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實習醫生日記之頑固失眠

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腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

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摘要:第一次利用兩個技術獨立的商業化熒光免疫組織化學分析平臺在個乳腺癌案例中分析與乳腺癌復發存在線性關系實驗結果可以作為今后其他平臺的檢測基準以及為病理學實驗室的操作人員提供客觀的腫瘤定量標記物這篇文章于年月發表于雜志上

第一次利用兩個技術獨立的商業化熒光免疫組織化學分析平臺,在382個乳腺癌案例中分析Nuc-Stat5與乳腺癌復發存在線性關系。實驗結果可以作為今后其他平臺的檢測基準以及為病理學實驗室的操作人員提供客觀的腫瘤定量標記物。這篇文章于2016年1月發表于Modern Pathology雜志上。

經福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片上的蛋白標記,一般在免疫組化染色后由病理學家通過視覺評估并打分。評估結果被用于腫瘤治療方案選擇以及確定新的預后和預測生物標志。但是由于視覺觀察免疫評分的限制性,一些新的免疫組化標記物無法被用于臨床應用。原因在于病理學家主觀評價腫瘤標志物基于免疫組化染色的密度,提供不連續的、定性而非定量的數據,而且結果受不同觀察者的影響。相對于人眼,數碼病理平臺的分辨率較高,具有更寬的動態范圍,不受主觀及肉眼視覺錯覺的限制,通過計算機協助的影像分析可以提供連續的可供定量的免疫組化數值。有些平臺經FDA批準可以用于臨床診斷乳腺癌,有些平臺可以利用多通道的熒光免疫組化檢測組織區域以確定亞細胞成分。可以通過特異性標志物的分子共存自動獲得特殊區域的強度得分。

基于免疫熒光圖像的蛋白表達定量代表到了一種優越的替代方案,優于基于染色的生物標記定量。其優點在于可以產生更多的動態信號區域,可以加強多通道染色,其對抗體的高敏感性意味著可以應用更低的抗體濃度、更短的孵育時間,以及更少的非特異性染色。在對乳腺癌β-catenin與 Her2的研究以及 AMACR前列腺癌研究中有文獻報道,定量熒光免疫組化分析平臺可以確定不被人眼辨識的攜帶免疫標簽的細胞。

經過10-15年的發展,現有的各種軟硬件平臺各具特色。但正因如此,很難確定客觀定量的免疫組化數據的有效性,尤其是其測量基準與免疫組化染色結果相沖突的時候。在缺乏建立定量免疫組化定量數據金標準的情況下,如果兩個獨立的多色免疫熒光分析平臺同時支持供應商選廠的提供客觀和定量的免疫組化數據,那么對腫瘤研究預后標志物的免疫組化數值應該高度一致并產生與臨床預測結果相比較的分析結果。

我們之前利用過PM2000影像系統(HistoRx/Genoptix)與AQUA影像軟件(HistoRx/Genoptix)對多色的蛋白標記物免疫組化數據進行過分析。可供替代的熒光免疫組化平臺聯合ScanScopeFL (Aperio/Leica Biosystems)進行影像捕捉與Tissue Studio (Definiens)進行影像分析。通過對細胞核定位水平、對酪氨酸磷酸化的Stat5a/b (Nuc-pYStat5)在乳腺癌組織中的微陣列組進行比較,在兩個獨立的熒光免疫組化平臺上經線性矯正后得出了高度一致的Nuc-pYStat5水平數值,客觀獨立確定了Nuc-pYStat5乳腺癌患者亞群的復發風險。更重要的是,在每個平臺建立的數據切割點(data-driven cutpoint)都可以成功移植到其他平臺上。新結論與之前利用PM2000/AQUA平臺研究的關于抗雌激素治療可以增加攜帶Nuc-pYStat5標記乳腺癌患者亞群的發病風險的結果相一致。

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

圖 1 使用兩平臺對323例乳腺癌患者細胞核pYStat5熒光免疫組化結果進行捕捉與定量。

分析:PM2000影像捕捉/AQUA軟件分析(PM2000/AQUA)與ScanScopeFL影像捕捉/TissueStudio軟件分析(ScanScopeFL/TissueStudio)結果高度一致。結果對數值用散點圖表示,Bland-Altman區分與均值回歸建立線性標定方程。粗線為從TissueStudio到AQUA的對數變換值轉換公式,細線代表95%的可信區間。兩個熒光免疫組化分析結果顯示在線性矯正后驚人的一致。

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

圖 2 AQUA和Tissue Studio量化并通過數據區分細胞核pYStat5水平可再生的確定了細胞核攜帶pYStat5標記的低腫瘤水平的雌激素受體陽性患者增加疾病的再發風險。

分析:使用PM2000/AQUA與 ScanScopeFL/TissueStudio平臺對193例雌激素受體陽性乳腺癌樣本中Nuc-pYStat5免疫組化定量。兩個平臺通過數據化的切割點分為低免疫組化檢測Nuc-pYStat5 (Nuc-pYStat5 IFlow)與高免疫組化檢測Nuc-pYStat5 (Nuc-pYStat5 IFhigh)的數據來自PM2000/AQUA(a)或ScanScopeFL/TissueStudio(c),每個平臺使用Kaplan–Meier分析非復發的生存率。兩個平臺確定了相似的細胞亞群,其患者腫瘤顯示低Nuc-pYStat5 (≈20%)增加了復發的風險。PM2000/AQUA上源于數據的光學切割點線性校準由ScanScopeFL/TissueStudio數據,使用公式ScanScopeFL/TissueStudio = 0.43+0.95 × PM2000/AQUA(b);ScanScopeFL/TissueStudio上源于數據的光學切割點線性校準由PM2000/AQUA數據,使用公式PM2000/AQUA = ? 0.45+1.06 × ScanScopeFL/TissueStudio(d)。來自第一個平臺的校準切割點被應用于第二個平臺并進行Kaplan–Meier分析(b和d)。

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

表格 1:雌激素受體陽性乳腺癌患者按Nuc-pYStat5高、低分類(通過特定平臺的數據源性割點和線性校準割點)

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

表格 2使用PM2000/AQUA與 ScanScopeFL/TissueStudio平臺對Nuc-pYStat5免疫熒光染色多元化分析

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

圖 3  AQUA和Tissue Studio 對細胞核pYStat5水平分析

分析:AQUA和Tissue Studio 對細胞核pYStat5水平分析結果與基于連續標記水平的臨床預測結果高度一致。在193例雌激素受體陽性乳腺癌患者使用PM2000/AQUA與 ScanScopeFL/TissueStudio平臺分析,兩個平臺使用receiver-operating曲線計算5年(a)與10年(b)的無復發生存率。相似的結果與1-12年觀察的生存曲線相似。重疊區域之下的receiver-operating曲線(c)。

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

圖 4 在193例雌激素受體陽性的乳腺癌腫瘤中,與病理學家對標準免疫組化染色打分相比較。

分析:增長的動態范圍為pYStat5在乳腺癌中表達提供了一個新的數據信息。(a)病理學家判斷染色陽性(DABhigh) 與陰性 (DABlow)作為判斷≥1%的免疫反應細胞核,在ER陽性乳腺癌患者的Kaplan–Meie分析中并不能確定Nuc-pYStat5作為一個腫瘤復發的標記物。(b)病人按基于高/低Nuc-pYStat5腫瘤情況的熒光免疫組化結果(IFhigh,IFlow)與基于陽性/陰性Nuc-pYStat5腫瘤情況的DAB染色結果(DABhigh, DABlow)被分為3組,進行時間分析。高分辨率與高敏感性熒光免疫組化允許對低Nuc-pYStat5表達腫瘤的升高復發風險進行評估。

腫瘤蛋白標記定量的有效性被兩個獨立的自動化免疫熒光圖像分析平臺確認

圖 5  兩個獨立操作者的操作比較

分析:兩個獨立操作者利用Tissue Studio分析在乳腺癌中Nuc-pYStat5熒光免疫組化分析。(a)兩個操作者(ARP與HR)遵循相同的Tissue Studio分析操作標準,對336例乳腺癌樣本的組織微陣列格式進行分析。在12個樣本中獨立選擇腫瘤組織并建立指南。操作者一致性分析顯示高一致性關聯系數0.993(95%可信區間:0.991,0.994)(b)另一個操作者一致性分析顯示高一致性關聯系數0.996(95%可信區間:0.995,0.997)在同一個操作者(ARP)使用Tissue Studio重復分析。實線證明其高度一致。

從兩個不同圖像分析技術平臺獲得的高度整合的數據,可以作為今后其他平臺的檢測基準以及為病理學實驗室的操作人員提供客觀的腫瘤定量標記物。將極大的增強我們在藥物研發以及癌癥個體化療法上所作出的努力。(生物谷Bioon.com)

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