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激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變

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摘要:稿件來自摘要淀粉樣蛋白沉積即老年斑是阿爾茨海默病患者病理特征之一此外雖然星形膠質細胞確切的病理作用尚不明確但是已經發現阿爾茨海默病患者頭腦中的膠質細胞活化本文中我們確定激肽釋放酶相關肽酶為星形膠質細胞源性降解酶信使核糖核酸的表達在阿爾茨海默病患者的腦中顯著下降消融加劇了阿
激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變
(稿件來自EMBO Molecular Medicine)
摘 要
淀粉樣蛋白‐β(Aβ)沉積(即老年斑)是阿爾茨海默病(AD)患者病理特征之一。此外,雖然星形膠質細胞確切的病理作用尚不明確,但是已經發現阿爾茨海默病患者頭腦中的膠質細胞活化。本文中,我們確定激肽釋放酶相關肽酶7(KLK7)為星形膠質細胞源性Aβ降解酶。?KLK7信使核糖核酸的表達在阿爾茨海默病患者的腦中顯著下降。Klk7?消融加劇了阿爾茨海默病模型小鼠的硫磺素S-陽性Aβ病理。Klk7的表達通過主要星形膠質細胞中的Aβ療法得以上調,這意味著Klk7通過Aβ誘發反應進行自我平衡調節。最后,我們發現食品和藥物管理局批準抗癡呆藥物美金剛胺能夠提高Klk7表達和Aβ降解活性,尤其是星形膠質細胞的降解活性。這些數據顯示KLK7是通過阿爾茨海默病發病機理中涉及的星形膠質細胞退化并清除沉積Aβ種類的重要酶素。
引 言
阿爾茨海默病(AD)是最常見的癡呆類型。基因和生化證據顯示,淀粉樣蛋白‐β(Aβ)沉積是阿爾茨海默病發病機理的重要過程(Holtzman等人,2011年)。淀粉樣前蛋白(app)發生蛋白水解作用后產生Aβ。有些基因突變與家族阿爾茨海默病增加或產生/累積Aβ相關。與此相反,報告稱零星阿爾茨海默病患者清除率降低,而大腦Aβ產生率上升(Mawuenyega?等人,2010年)。因此,了解反映產生、清除并累積Aβ速率平衡的大腦“Aβ經濟”分子機制(Karran等人,2011年)對阿爾茨海默病的有效療法開發非常關鍵。但是,病理生理學Aβ清除/降解途徑在大腦中的整體框架尚不明確(Saido和 Leissring,2012年)。迄今為止,有些酶素,包括腦啡肽酶(膜金屬內肽酶)和胰島素降解酶已經確定為Aβ降解酶(Nalivaeva 等人,2014年)。其中,小鼠體內的腦啡肽酶和胰島素降解酶清除顯示可溶大腦Aβ水平大約提高雙倍,即使對活有機體內部Aβ沉積的影響仍然充滿爭議((Iwata等人,2000年和2001年;Farris等人,2003年;Leissring等人,2003年)。重要的是,在治療環境中,剩余神經元可能并非阿爾茨海默病治療過程中清除Aβ沉積的適當靶點。因此,我們側重星形膠質細胞,星形膠質細胞在大腦生理和病理功能中發揮著重要的作用((De Strooper 和Karran,2016年; Pekny等人,2016年)。星形膠質細胞外表型發生顯著變化,但數量并未發生變化,這與阿爾茨海默病的臨床病理學相關(Serrano‐Pozo等人,2013年)。
但是,星形膠質細胞調節Aβ清除的明確機制依然尚不明確。
已經確定十五種激肽釋放酶相關肽酶7(KLK7)家族蛋白,這些蛋白在復雜的網絡中產生級聯反應。其中,KLK6(甘油磷酸鈣)和KLK8(neuropsin)是中樞神經系統中主要的激肽釋放酶相關肽酶蛋白(Sotiropoulou?等人,2009年;Prassas?等人,2015年)。KLK6在幾種細胞中的表達廣泛,KLK8在神經元中表達。同時,KLK8也在阿爾茨海默病的發病機理中有所表示(Herring等人,2016年)。KLK7最初確定為皮膚中的炎癥誘發蛋白酶。但是,阿爾茨海默病患者腦脊液和大腦中的KLK7表達水平下降((Diamandis等人,2004年; Bossers等人,2010年)。此外,報道稱KLK7能夠打通Aβ小纖維的輸水核心結構,從而降低體外的神經中毒性(Shropshire等人,2014年)。在本文中,我們調查了KLK7在大腦Aβ經濟中的病理生理學影響并確定KLK7為星形膠質細胞源性Aβ降解酶,星形膠質細胞源性Aβ降解酶能夠調節活有機體內部的淀粉樣蛋白病理。
結 果
KLK7確定為Aβ降解酶
為確定能夠降解分泌Aβ種類的蛋白酶,我們利用了7PA2細胞中的條件培養基作為基質源,因為7PA2細胞分泌有毒人體Aβ低聚體種類(Podlisny等人,1995年)。我們利用若干細胞系的條件培養基并將其與7PA2細胞的條件培養基進行混合。混合物通過含尿素的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠進行分離,含尿素的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠使我們能夠區分Aβ免疫印跡不同的C-末端長度(Klafki等人,1996年;Qi‐Takahara等人,2005年)。我們發現星型細胞瘤CCF‐STTG1、神經膠質瘤H4、神經胚細胞瘤SH‐SY5Y和膠質母細胞瘤U87細胞的介質在此條件下表現出強健的Aβ降解活性(圖1A和附錄圖S1A 和B)。此外,CCF‐STTG1細胞的介質也在人神經母細胞瘤BE(2)‐C細胞產生的Aβ上表現出降解活性(附錄圖S1C)。然后我們利用具有最強活性的CCF‐STTG1細胞進一步表征降解活性。這種活性特別通過二異丙基氟磷酸鹽和甲苯磺酰基苯內氨酛基氯甲基酮(圖1B和 C)進行抑制,這說明Aβ降解需要分泌的糜蛋白酶類絲氨酸蛋白酶。膦酰二肽、乙二胺四乙酸和GM6001均不會抑制這種活性,這說明這種分解代謝途徑并不涉及金屬蛋白酶(Fig1B和D)((Iwata等人,2000年;Yin等人,2006年)。但是,已知Aβ降解絲氨酸蛋白酶的抑制劑【如纖維蛋白溶酶的抗纖維蛋白溶酶((Van Nostrand 和Porter,1999年)和酰基肽水解酶乙酰蛋氨酸(Yamin等人,2007年)】并未抑制這種活性(圖1E)相反地,鋅離子降低了這種活性(圖1F)。這種特殊特性使我們調查了KLK7可能具備的功能,其中之一為分泌的鋅敏感糜蛋白酶類絲氨酸蛋白酶(Debela等人,2007年)。
激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變
圖1 星型細胞瘤細胞系條件培養基中的Aβ降解活性藥理分析
1.Aβ在CCF‐STTG1和U87細胞條件培養基中的降解活性。介質使用7PA2細胞條件培養基潛伏24小時。混合物中剩余的Aβ通過免疫印跡法直觀化。24小時后,7PA2細胞分泌的Aβ完全消失,并且通過添加完整的蛋白酶抑制劑混合物對其進行抑制。
2.添加二異丙基氟磷酸鹽或完整的蛋白酶抑制劑混合物使Aβ任然處于混合培養基中。異丙氟磷、二異丙基氟磷酸鹽;PR、膦酰二肽;季戊四醇磷酸酯和胃蛋白酶抑制劑A。
3.甲苯磺酰基- L -賴氨酰基-氯甲烷鹽酸化物或甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮對CCF‐STTG1 細胞條件培養基中Aβ降解活性的影響。甲苯磺酰賴氨酸氯甲基酮、甲苯磺酰基- L -賴氨酰基-氯甲烷鹽酸化物;甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮。
4.金屬蛋白酶抑制劑基質和GM6001對CCF‐STTG1 細胞條件培養基中Aβ降解活性的影響。
5.已知Aβ降解絲氨酸蛋白酶抑制劑對CCF‐STTG1 細胞條件培養基中Aβ降解活性的影響。AcMet、乙酰蛋氨酸;αplasmin、α2‐抗纖維蛋白溶酶。
6.鋅離子對CCF‐STTG1 細胞條件培養基中Aβ降解活性的影響。
報道稱KLK7能夠打通體外Aβ小纖維的輸水核心結構(Shropshire等人,2014年)。阿爾茲海默病患者的腦脊液和大腦中的KLK7表達水平下降(Diamandis等人,2004年;Bossers等人,2010年)。但是,目前尚不明確KLK7是否參與活有機體內的大腦淀粉樣病變。我們確認KLK7?信使核糖核酸在日本阿爾茲海默病患者的大腦中降低50%左右(圖2)(Miyashita等人,2014年),這與布拉克神經元纖維纏結階段密切相關(附錄圖S2)。此外,我們分析了人體KLK7信使核糖核酸在AMP‐AD知識門戶中儲存的兩種公共RNAseq數據集中的表達水平:Mayo RNAseq(MayoRNAseq)(Allen等人,2016年)和西奈山腦庫(MSBB)AD組群。在Mayo樣本集中,阿爾茲海默病患者顳葉皮層中的KLK7?抑制大幅降低(錯誤發現率(FDR)<0.05,β=?0.623)。同樣地,與淀粉樣蛋白斑塊負荷增加相關的KLK7表達在西奈山腦庫樣本集中大幅降低(布洛德曼(BM)分區22的錯誤發現率<0.01,BM36的錯誤發現率<0.05)。
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圖2:阿爾茨海默病患者大腦中的KLK7mRNA表達分析
箱形圖和盒須圖顯示對照(Ctrl)受試者(n=24)和阿爾茨海默病患者(n=29)人體解剖大腦樣本中KLK7的相對mRNA表達水平。箱形圖顯示中位數(中間實線)±25%。盒須圖顯示分別低于1.5倍四分位差25%或高于1.5倍四分位差75%的范圍內的最小值或最大值。KLK7mRNA (Hs01012730_g1, Hs00192503_m1, Hs01012731_m1)的不同TaqMan探針用于qRT–PCR分析。GUSBmRNA水平(TaqMan探針Hs99999908_m1)標準化KLK7mRNA的相對表達,展示了AD患者和對照受試者之間可比較的表達情況。曼-惠特尼U檢驗對對照受試者和阿爾茨海默病患者進行數據分析。***P<0.001。
為測試KLK7是否與Aβ降解有關,我們檢查了特定的KLK7中和抗體(MAB2624)(Bin等人,2011年)。添加MAB2624明顯減少了CCF‐STTG1細胞的Aβ降解活性(圖3A和B,附錄圖S3A)。而且,COS‐1細胞中的條件培養液過量表達KLK7,表明降解活性抑制天然分泌的Aβ(圖3C和附錄圖S3B),而增加MAB2624摧毀了降解活性的這一特點。最后,重組凈化的人類KLK7共同溫育(非KLK6)源自哺乳動物細胞或有源自7PA2的Aβ或合成Aβ的細胞,導致試管內重大Aβ降解(圖3D和附錄圖S3C-E),表明KLK7與Aβ降解直接相關。KLK7降解合成的Aβ小纖維(圖3E),與先前結果一致(Shropshire等人,2014年)。為進一步說明KLK7在小鼠星形膠質細胞中的作用,我們分析了從新生大鼠中取得的原代神經膠質細胞。這一培養過程主要由原代星形膠質細胞組成,但同樣包括原代小神經膠質細胞。特別是,只在Aldh1L1陽性原代星形膠質細胞中發現了Klk7陽性點,并未在Iba‐1陽性小神經膠質細胞中發現Klk7陽性點(附錄圖S4A)。原代神經膠質細胞培養而成的條件培養液同樣表明受KLK7中和抗體抑制的獨立于糜蛋白酶類絲氨酸蛋白酶的Aβ降解活性(圖4A和B,附錄圖S4B)。其他蛋白酶可能同樣與Aβ降解有關,因為MAB2624在本次試驗中表現部分抑制情況。這些結果表明獨立于Klk7的Aβ降解活性與星形膠質細胞有關。

激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變
圖3:KLK7與Aβ降解活性有關
1.使用MAB2624(KLK7‐中和抗體)抑制CCF‐STTG1細胞的Aβ降解活性。印跡下是相對剩余Aβ40和Aβ42在正常培養液和條件培養液混合液中的量化情況(n=3,平均值±平均數標準誤差,根據t檢驗, *P<0.05)。
2.使用MAB2624進行CCF‐STTG1細胞Aβ降解活性的劑量相關性抑制。印跡下是相對剩余Aβ40在正常培養液和條件培養液混合液中的量化情況(n=3,平均值±平均數標準誤差,根據圖基檢驗,**P<0.01)。
3.Aβ降解活性在COS‐1細胞條件培養液中表達人類KLK7。印跡下是相對剩余Aβ40在正常培養液和條件培養液混合液中的量化情況(n=3,平均值±平均數標準誤差,根據圖基檢驗,***P<0.001)。
4.重組KLK7蛋白的Aβ降解活性。文中列出了對7PA細胞的正常培養液和條件培養液混合液中剩余Aβ以及重組人類KLK7和KLK6蛋白進行的免疫印跡分析
5.通過凈化的MBP示蹤的hKLK7蛋白對預成型Aβ小纖維進行試管內降解。硫代黃素T熒光性測量Aβ小纖維的數量,在每個時間點顯示相對熒光水平(n=3,平均值±平均數標準誤差,根據圖基檢驗,*P<0.05, **P<0.01)。
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圖4:Klk7與原代星形膠質細胞條件培養液中的Aβ降解活性有關
1.原代星形膠質細胞條件培養液中的Aβ降解活性。需要注意的是,二異丙基氟磷酸和甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)抑制降解活性的方式與CCF‐STTG1細胞條件培養基中觀察到的抑制方式類似。DIFP——二異丙基氟磷酸;TLCK——n-甲苯磺酰-l-賴氨酰-氯甲基酮;TPCK——甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮。
2. KLK7中和抗體MAB2624對原代星形膠質細胞的Aβ降解活性的影響。印跡下是相對剩余Aβ40和Aβ42在正常培養液和條件培養液混合液中的量化情況(n=3,平均值±平均數標準誤差,根據t檢驗,**P<0.01)。
大腦Aβ病理學中KLK7的重要性
之后,我們使用帶Klk7tm1(KOMP)VlcgVelociGene刪除等位基因的胚胎干細胞培養了一群純合Klk7基因剔除小鼠(Klk7?/?)。Klk7?/?小鼠表現正常,生育能力良好,完全摧毀了他們的Klk7mRNA表達(附錄圖S5A–C)。并且,MAB2624 未能抑制從Klk7?/?小鼠中獲得的原代精神膠質培養液的條件培養液中的Aβ降解,表明MAB2624在降解試驗中明顯抑制KLK7蛋白的蛋白水解活性(附錄圖S5D)。然而,商業化抗體未能發現使用免疫印跡的內源性大腦KLK7蛋白。之后,我們分析了內源性鼠類大腦中的Aβ水平,發現Aβ水平在雄性和雌性Klk7?/?小鼠大腦中呈1.4倍到兩倍的增長(附錄圖S5E)。未觀察到APP、APP蛋白水解片段、ADAM10、BACE1、γ分泌酶復合物、ApoE、腦啡肽酶、胰島素降解酶或基質金屬蛋白酶9表達水平的變化(附錄圖S5F)。將重組KLK7蛋白注入野生小鼠的海馬體中明顯地減少了小鼠大腦中的Aβ水平,這一現象支持Klk7 從生理方面參與大腦Aβ分解代謝的理念(附錄圖S5G)。之后,我們在沒有Klk7的情況下檢查了App基因敲入小鼠的淀粉樣蛋白病理形態(Saito等人,2014年,2016年)。純合AppNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠在1-2個月大時出現皮質淀粉樣蛋白沉積,在6-7個月大時出現被膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星形膠質細胞包圍的硫黃素S陽性斑塊。由于在夾心式酶聯免疫吸附測定中基因敲入等位基因中的北極突變促進聚合(Nilsberth等人,2001年)并減少免疫反應活性(Saito等人,2014年),我們使用免疫印跡法比較了大腦Aβ水平(圖5A-C和附錄圖S6A-C)。在不影響APP和相關蛋白的情況下,刪除基因Klk7?,我們觀察到3個月大的AppNL‐G‐F/NL‐G‐F 小鼠大腦中添加可溶性三羥甲基氨基甲烷緩沖劑的大腦Aβ水平明顯增加(附錄圖S7A)。并且,不可溶的Aβ(如,可溶性SDS和可溶性甲酸)數量同樣增加了。appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7?/?小鼠大腦中的淀粉樣沉積物同樣大幅度增加了(5.6倍),與生化分析結果一致(圖5D和E)。這些數據表明Klk7損失的重大影響,這些影響不僅表現在生化Aβ經濟,而且表現在Aβ斑塊的沉積規律上。
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圖5 Klk7基因缺陷增加了appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠的大腦Aβ水平和淀粉樣病變
●A–C 在3月齡appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7-1雄性小鼠大腦中的Tris緩沖液可溶性(A)、SDS可溶性(B)和甲酸可溶性(C)組分中對人類Aβ進行生物化學分析。箭頭表示總Aβ。附錄圖S6顯示了Aβ相對水平的定量。
●D. 利用82E1抗體(紅色)對3月齡appNL‐G‐F/NL‐G‐F;Klk7-1雄性小鼠大腦進行免疫組織化學分析。放大的圖像如下所示。比例尺:100微米。D。
● E. 顯示了皮質82E1陽性總Aβ斑塊(左)和皮質硫代黃素S陽性Aβ斑塊(右)的定量結果(學生測試結果:n = 3或4,平均值±sem,*** P <0.001)。
我們進一步分析了與Aβ沉積有關的病理變化。我們觀察到小鼠內源性tau(附錄圖S8A和B)的加速磷酸化以及appNL‐G‐F/NL‐G‐F; Klk7-1小鼠大腦中確定新基點1累積營養不良性神經突(附錄圖S8C)的形成(Kandalepas等,2013年)。此外,在同基因小鼠中檢測到增加的硫代黃素S陽性淀粉樣斑塊(圖5E)以及斑塊周圍的GFAP陽性膠質增生(附錄圖S8D),這一發現為我們的觀點提供支持性依據,即淀粉樣蛋白誘導的神經炎/星形細胞變化在同基因小鼠中擴張。值得注意的是,雖然GFAP的表達顯著增加,但Aldh1L1水平不受Klk7基因消融的影響,表明存在激活而星形膠質細胞數量無變化(附錄圖7B)。總之,這些結果表明Klk7是大腦Aβ經濟的關鍵組分,并減弱AD模型小鼠中的大腦淀粉樣蛋白病理學。
Aβ處理和美金剛胺激活Klk7表達
KLK7是激肽釋放酶相關肽酶級聯中的末端蛋白酶,并且由KLK5介導的前結構域去除直接激活(Sotiropoulou等人,2009年)。重要的是,內源性KLK抑制劑絲氨酸肽酶抑制劑Kazal類型5(SPINK5)缺失導致的KLK5和KLK7活性上調導致特應性皮炎相關的疾病,包括Netherton綜合征(Furio&Hovnanian,2014年)。然而,Klk7 mRNA表達通過皮膚中的細胞因子選擇性調節(Morizane等,2012年),表明Klk7 mRNA的轉錄受特定機制的控制。事實上,Klk7 mRNA表達在appNL‐G‐F/NL‐G‐Fmice中顯著且選擇性地增加(圖6A)。此外,Klk7而不是其他Aβ降解酶(即基質金屬蛋白酶、中性溶酶和胰島素降解酶)的mRNA表達以年齡依賴性方式進一步特異性增強(圖6B和附錄圖S9)。有趣的是,用Aβ42而不是脂多糖處理原代星形膠質細胞顯著增加Klk7的表達(圖6C和D)。雖然我們不能排除脂多糖在Klk7中可能具有一定的調節作用,但這些結果表明Klk7轉錄通過星形膠質細胞中的Aβ選擇性調節,并且可能選擇性增加Klk7表達。
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圖6星形膠質細胞中Aβ對Klk7表達的上調
1.5月齡雄性appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠大腦中Klk5、Klk6、Klk7和Spink5 mRNA的相對水平(學生測試結果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P<0.01)。
2.5月齡和13月齡雄性appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠的Klk7 mRNA水平(學生測試結果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P <0.01)。
3. Aβ肽對從野生型小鼠獲得的原代星形膠質細胞中Klk7 mRNA表達的影響(學生測試結果:n = 6,平均值±s.e.m.,* P <0.05)。
4. 1微克/毫升脂多糖對從野生型小鼠獲得的原代星形膠質細胞中Klk7 mRNA表達的影響(學生測試結果:n = 6,平均值±s.e.m.,* P <0.05)。
我們最近研究了美金剛胺(美國食品和藥物管理局批準的抗癡呆藥物和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑)對原代培養物中Aβ代謝的影響(Ito等人,2017年)。我們注意到,美金剛胺治療僅在原代神經元和神經膠質共培養的條件培養液中顯著減少了加入標準的人類Aβ,但是在原代神經元培養物的條件培養液中未顯著減少加入標準的人類Aβ(圖7A和B)。另外,我們以及其他人已經發現,美金剛胺Tg2576 app轉基因小鼠的慢性治療降低了Aβ水平(Dong等人,2008年;Ito等人,2017年)。因此,我們假設美金剛胺會影響星形膠質細胞中的Klk7mRNA表達和大腦中的Aβ沉積。美金剛胺處理的Tg2576小鼠腦中的Klk7mRNA水平特異性上調(圖7C),其也支持這一觀點。此外,美金剛胺增加主要星形膠質細胞中的Klk7 mRNA。然而,N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑MK-801未能在原代星形膠質細胞中誘導Klk7mRNA(圖7D)。有趣的是,谷氨酸以及N-甲基-D-天冬氨酸處理顯著降低了Klk7 mRNA水平,表明MK-801不敏感的星形細胞谷氨酸信號傳導可能涉及Klk7表達的調節(圖7E)。我們還發現,從美金剛胺處理的原代星形膠質細胞中獲得的條件培養液顯著增強了Aβ降解效率(附錄圖S10)。這種效應在來自Klk7淘汰小鼠的星形膠質細胞中消除(圖7F)。這些數據表明星形細胞Klk7表達通過小鼠腦中的Aβ調節,并且由美金剛胺選擇性地上調。
激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變
圖7美金剛胺對Klk7依賴性Aβ降解活性的影響
●A, B美金剛胺在人類Aβ加標實驗中的作用。在DIV8用或不用30微米美金剛胺(Mem)處理原代神經元培養物或神經元和神經膠質共培養物。將30微米的合成人類Aβ42肽摻入這些培養物中。(B)顯示了通過人類Aβ特異性夾層酶免疫吸附測定法體外測定幾天內剩余人類Aβ42的水平(學生測試結果:n = 6,平均值±s.e.m.,*** P <0.001)。
●C. 美金剛胺(Mem)治療的雌性Tg2576小鼠腦中Klk5、Klk6、Klk7和Spink5 mRNA的相對水平(學生測試結果:n = 5或4,平均值±s.e.m.,* P <0.05)
●D. 30微米美金剛胺或10微米MK-801對野生型小鼠原代星形膠質細胞中的Klk7 mRNA表達的影響(Tukey測試結果:n = 5或6,平均±s.e.m.,** P <0.01)。
●E. 20微米谷氨酸或50微米N-甲基-d-天冬氨酸對野生型小鼠原代星形膠質細胞中Klk7 mRNA表達的影響(Tukey測試結果:n = 5或6,平均值±s.e.m.,** P <0.001)。
● F. 30微米美金剛胺對野生型或Klk7?/?小鼠原代星形膠質細胞的條件培養液中Aβ降解活性的影響。對剩余的Aβ40和Aβ42進行定量(學生測試結果:n = 4,平均值±s.e.m.,* P <0.05,** P <0.01)。
討 論
在這項研究中,我們確定KLK7是大腦Aβ經濟調節中重要星形細胞的關鍵組分。我們觀察到Klk7?/?小鼠大腦中內源性Aβ水平增加1.4倍至兩倍,這幾乎與體內腦啡肽酶或胰島素降解酶基因缺失的影響相當(Saido&Leissring,2012年)。此外,Klk7缺失增加AD模型小鼠中硫代黃素S-陽性淀粉樣蛋白沉積。因此,KLK7是關鍵的Aβ降解酶之一,這表明星形膠質細胞參與調節通過Klk7途徑的Aβ發病機制。據報道,KLK7能夠切割Aβ原纖維的疏水核心基序并在體外降低細胞毒性(Shropshire等,2014年)。與此結果一致,我們發現appNL‐G‐F/NL‐G‐F小鼠表現出加速的神經炎變化和炎癥反應(即增加的tau磷酸化、營養不良性神經突和反應性星形膠質細胞)。然而,我們沒有觀察到大腦中神經元數量和同類小鼠行為的顯著變化,這可能是由于模型小鼠的年齡較小。盡管如此,尚不清楚大腦中KLK7上調是否通過降解其他底物引起有害作用。通過蛋白質組學方法了解大腦中KLK7的生理功能和底物很重要(Yu等人,2015年)。
Aβ處理選擇性誘導體外Klk7的表達,并且Klk7表達與AD模型小鼠中的Aβ沉積相關。Aβ上調KLK7 mRNA的分子機制尚不清楚。然而,KLK7與皮膚炎癥有關(Furio&Hovnanian,2014年;Prassas等,2015年)。有趣的是,抗炎Th2細胞因子,如白介素-4和白細胞介素-13,增加人類角質形成細胞中KLK7 mRNA的表達(Morizane等,2012年)。這些數據表明Klk7表達通過星形膠質細胞中受Aβ誘導的炎癥反應進行自我平衡調節。值得注意的是,也增加了反應星形膠質細胞中其他Aβ降解酶、基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的表達(Yin等人,2006年),盡管不溶性Aβ的水平在Mmp2或Mmp9淘汰小鼠大腦中未受影響,這也表明KLK7在清除體內聚集的Aβ低聚體形式中起主要作用。然而,調節星形膠質細胞中星形膠質細胞反應以增加KLK7表達將是一種新的減少Aβ沉積的治療方法(De Strooper&Karran,2016年)。
然而,與模型小鼠相反,我們發現在腦中具有顯著Aβ沉積的AD患者中KLK7 mRNA顯著降低。重要的是,AD模型小鼠不反映人類AD大腦的所有特征(例如纏結和主要神經元丟失的形成)。因此,這些病理變化可能會影響KLK7 mRNA的表達。此外,縱向研究顯示Aβ沉積在臨床癥狀出現之前開始10至15年(De Strooper&Karran,2016年)。因此,其他可能性為:Aβ沉積引起的延長炎癥反應可能改變星形膠質細胞的表型以減少人腦中的KLK7表達,雖然這種病理表型的機制尚不清楚。值得注意的是,KLK7 mRNA的表達通過癌細胞系中組蛋白的甲基化調控(Raju等人,2016年)。分析AD大腦中KLK7的表觀遺傳調節和/或星形膠質細胞的活化狀態非常重要。
本研究最重要的發現是美金剛胺體外和體內治療增加了Klk7表達。美金剛胺在聯合療法方面具有很大的潛力,有助于促進淀粉樣蛋白的清除,例如除免疫療法或甚至作為通過免疫療法成功去除淀粉樣蛋白后的單一療法。獲得對美金剛胺誘導的選擇性Klk7的機理認識將為開發星形膠質細胞靶向AD治療做好鋪墊。值得注意的是,正確的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑MK-801未能影響Klk7 mRNA的表達,而谷氨酸以及N-甲基-D-天冬氨酸降低了Klk7的水平。這一結果表明,星形膠質細胞中的N-甲基-D-天冬氨酸受體對這些拮抗劑與神經元中的拮抗劑有不同的反應。事實上,已經強調了不同于神經元中神經膠質N-甲基-D-天冬氨酸受體的異常亞單位組成(Dzamba等人,2013年),這提高了MK-801不敏感新型星形細胞N-甲基-D-天冬氨酸受體參與Klk7表達調節的可能性。有趣的是,無論傳統的N-甲基-D-天冬氨酸受體表達如何,美金剛胺誘導了T細胞中Th2細胞因子的表達(Kahlfuss等人,2014年)。因此,美金剛胺可能調節星形膠質細胞中的抗炎細胞因子信號傳導以通過新機制增加Klk7表達。重要的是,美金剛胺對皮膚的顯著不良反應尚未報道,這表明美金剛胺治療不足以引起KLK7過度激活導致的皮膚疾病表型(Hansson等人,2002年)。然而,了解KLK7介導Aβ降解在分子水平的調節機制應提供對星形膠質細胞的病理作用以及其作為針對AD治療靶標可能性的新見解。(生物谷Bioon.com) 溫馨提示:87%用戶都在生物谷APP上閱讀,掃描立刻下載! 天天精彩!
激肽釋放酶相關肽酶7損失加劇阿爾茨海默病模型小鼠淀粉樣病變
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