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應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

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摘要:亮點免疫組化等傳統組織蛋白原位檢測方法不適用于長鏈非編碼的可視化但原位雜交技術可以在完整的形態背景下檢測單細胞水平表達下述研究利用技術檢測了腫瘤組織中幾個并分析了該其與基質細胞的關系這項研究表明檢測技術可原位檢測肺癌樣本中的生物

亮點

免疫組化(IHC)等傳統組織蛋白原位檢測方法不適用于長鏈非編碼RNAs(lncRNA)的可視化,但RNAscope® RNA原位雜交技術可以在完整的形態背景下檢測單細胞水平lncRNA表達。下述研究利用RNAscope®技術檢測了腫瘤組織中幾個lncRNAs并分析了該其與基質細胞的關系。這項研究表明,RNAscope®檢測技術可:
· 原位檢測肺癌樣本中的lncRNA生物標志物;
· 精準識別lncRNAs的空間表達模式,包括腫瘤內異質性表達和腫瘤vs.間質表達;
· 鑒定lncRNAs特異性細胞類型及其亞細胞定位。

引言——lncRNAs & RNAscope

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)參與許多生物學過程,包括表觀遺傳修飾、細胞分化和凋亡。近期研究表明,lncRNAs是一種獨特的生物標志物,可能與生理或疾病狀態有關,已有幾種lncRNAs被認定為多種人類癌癥的生物標志物1。因為其不能翻譯成蛋白質,lncRNAs的發現完全依賴于RNA檢測。大多數lncRNAs表達水平偏低,且與mRNA相比,表達異質性較強。因此,腫瘤組織中的lncRNAs檢測要求使用高靈敏度和高特異性的方法,可以識別lncRNA在單細胞水平的其亞細胞定位。

單分子RNA原位雜交(ISH)可以在完整的形態學背景下檢測到單個RNA分子,非常適用于檢測腫瘤組織中lncRNAs。

為探索lncRNAs在腫瘤組織的表達模式及其所處的微環境,我們使用RNAscope®檢測技術進行RNA原位雜交。該方法是一種獨特的RNA原位雜交技術,可在完整的空間與形態背景下,表征單細胞水平的基因表達。RNAscope®檢測技術采用了獨特的雙Z探針設計及信號放大策略,同時抑制了背景,檢測新鮮冷凍、固定冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的細胞和組織中的mRNA與lncRNA,可以將目標RNA可視化為單一的信號點,一個信號點對應一個RNA分子2。RNAscope®技術的關鍵優勢在于基于放大策略的高靈敏度以及基于雙Z探針設計的高特異性,使其在大多數組織中有很高的信噪比。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

「優勢看得見」用RNAscope® 2.5HD檢測試劑盒(紅色)可視化人非小細胞肺癌福爾馬林固定石蠟包埋組織中的lncRNAs表達。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

相逢欲話

應用RNAscope® 2.5HD檢測試劑盒(紅色),在56例原發性非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤組織和4例癌旁肺組織的石蠟包埋組織芯片中,檢測了4種肺癌預后標志物lncRNAs(AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1)的表達3-6,以及前列腺癌特異性標志物lncRNA PCA3的表達。

情理之中

這4種肺癌預后標志物lncRNAs在各組織樣本中的表達水平存在差異,在56例NSCLC腫瘤組織中,近一半的樣本組織中可以檢測到上述4種lncRNAs表達,而在4例癌旁組織中并未檢測到相關表達(圖1;表1)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

   
圖1.一系列 lncRNAs在NSCLC腫瘤組織中的表達水平。應用RNAscope® 2.5HD檢測試劑盒(紅色),在60例NSCLC樣本中檢測5種lncRNAs(AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR、UCA1和PCA3)的表達。觀察每種lncRNA的(高、中、低、無)表達水平。在本項研究中,癌旁正常組織中沒有檢測到任何lncRNAs表達信號。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

    
表 1. RNAscope®染色評分匯總。NSCLC腫瘤組織中特定RNAscope®染色評分的分布。根據明視野顯微鏡下染色信號點的數目對染色結果進行評分:0,無染色或每10個細胞<1個染色信號點;1+,每個細胞存在1-3個信號點;2+,每個細胞存在4-10個信號點且不存在或僅存在極少的信號點聚集;3+,每個細胞存在10-15個信號點且<10%信號點聚集;4+,每個細胞存在>15個信號點且>10%信號點聚集。*陽性表達率根據在除癌旁正常組織外的所有NSCLC腫瘤組織內的RNAscope?染色評分≥1的染色信號點計算。

有趣的是,我們還觀察到,PCA3在16例癌組織中呈現較低表達,而在癌旁組織中卻未檢測到相關表達(圖1)。僅有部分研究表明肺癌組織中存在PCA3表達。RNAscope®技術靈敏度高,即使RNA生物標志物的表達水平較低,也可以被檢測出來,使研究人員可以在多種組織中檢測lncRNAs的表達。此外,盡管有3種肺癌預后標志物lncRNA在68%的NSCLC腫瘤組織中可以檢測到表達,這也并不表示在同一腫瘤組織內同時存在這些lncRNAs表達(圖2)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

   
圖2. 不同種lncRNA在同一NSCLC腫瘤組織中的表達差異。盡管有3種lncRNAs檢測到在68%的NSCLC腫瘤組織中表達,但并非每個腫瘤組織都存在相同的lncRNA表達譜。(A)在組織1E5中,HOTAIR的表達水平高于AFAP1-AS1、ANRIL或UCA1。(B)在組織1F3中,AFAP1-AS1的表達水平明顯高于ANRIL、HOTAIR或UCA1。(C)有部分組織也檢測到這4種肺癌預后生物標記物lncRNA表達。右圖為左圖紅色框放大內容,顯示的是在同一染色區域內,連續切片在組織1D5中AFAP1-AS1、ANRIL、HOTAIR和UCA1的染色情況。

在56例NSCLC腫瘤組織中還觀察到一些有趣的lncRNA表達模式。首先,這4種肺癌lncRNA生物標志物主要表達在腫瘤細胞中,而很少甚至不在基質細胞中表達(圖3)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

  
圖3. 腫瘤和基質質中的lncRNA表達評估。lncRNA主要表達于腫瘤細胞,很少甚至不在基質中表達。為了證實這一點,我們使用HALO數字成像分析軟件,對lncRNA在腫瘤中(黃色框)、基質質(綠色框)以及整個腫瘤核心區域(紅色框)中的表達水平進行了量化分析。每個細胞的平均信號點代表每個區域的數量。

第二,AFAP1-AS1在多個腫瘤組織內呈現出異質性表達,包括相鄰腫瘤灶存在表達或無表達,以及在腫瘤細胞之間存在表達差異(圖4)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

   
圖4. AFAP1-AS1在多種NSCLC腫瘤中的瘤內異質性表達。在本研究中,并非所有的腫瘤細胞均存在檢測的這幾種lncRNAs表達。(A)同一個NSCLC組織的鄰近病灶存在不同的AFAP1-AS1表達模式。一個病灶中檢測出AFAP1-AS1陽性腫瘤細胞(箭頭),而另一個臨近病灶卻檢測出AFAP1-AS1陰性腫瘤細胞(星號)。為了確保陰性病灶中RNA質量符合研究標準,我們對管家基因PPIB進行了研究,發現PPIB在兩個病灶中表達一致。(B)在同一腫瘤區域內的兩個NSCLC腫瘤核心區域,同時檢測出AFAP1-AS1陽性腫瘤細胞(箭頭)和陰性腫瘤細胞(星號)。

第三,在一些NSCLC腫瘤組織中,高表達的UCA1幾乎主要位于與腫瘤相關的基質細胞中(圖5)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

圖5. 多種NSCLC腫瘤中UCA1在腫瘤相關基質細胞中的表達。在一些NSCLC腫瘤組織中檢測UCA1表達,檢測結果發現僅在腫瘤相關基質細胞的細胞亞群中存在lncRNA高表達。

最后,由于ANRIL和HOTAIR均通過表觀遺傳機制調節基因表達,我們采用RNAscope®2.5 HD雙通道試劑盒檢測這兩個lncRNAs與染色質重組因子EZH2 mRNA的共表達。在一些NSCLC腫瘤組織中,我們觀察到ANRIL或HOTAIR與EZH2的共表達情況主要存在于腫瘤細胞中(圖6)。

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

圖6. lncRNA與染色質重組因子EZH2在多種NSCLC腫瘤中的共表達。用RNAscope® 2.5 HD多通道檢測試劑盒檢測發現ANRIL(A)或HOTAIR(B)lncRNA(紅)與EZH2 mRNA (綠)主要共表達于腫瘤細胞。

意料之外

此項研究中,應用RNAscope®原位雜交技術,在60例NSCLC福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織的腫瘤微環境中,評估幾種肺癌預后生物標志物lncRNAs的表達譜。檢測結果表明,該檢測技術能夠原位檢測肺癌樣本中潛在的生物標志物lncRNA,而且具有較高的靈敏度和特異性,可以有效識別組織環境中的lncRNA表達異質性和確定腫瘤組織中的lncRNA表達模式。鑒定細胞類型特異性和lncRNA表達的亞細胞定位有助于理解lncRNA在癌癥和其他疾病中的特定生物學作用。

     
更多信息請訪問
www.acdbio.com/lncRNA

掃描二維碼,查看或獲取該研究PDF

應用RNAscope®原位雜交技術分析肺癌中lncRNAs的細胞和亞細胞定位

    
Reference:
1.Schmitt AM and Chang HY. Long noncoding RNAs in cancer pathways. Cancer Cell. 2017; 29: 452-463.
2.Wang F, et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 2012;14(1):22-9.
3.Deng J, et al. The up-regulation of long non-coding RNA AFAP1-AS1 is associated with the poor prognosis of NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 2015; 75:8-11.
4.Lin L, et al. Increased expression of the long non-coding RNA ANRIL promotes lung cancer cell metastasis and correlates with poor prognosis. Diagn Pathol. 2015; 10: 14.
5.Liu XH, et al. The long non-coding RNA HOTAiR indicates a poor prognosis and promotes metastasis in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2013; 13: 464.
6.Wang HM, et al. Upregulated IncRNA-UCA1 contributes to progression of lung cancer and is closely related to clinical diagnosis as a predictive biomarker in plasma. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(7): 11824-30.

「RNAscope技術」微課堂

RNAscope技術是由美國Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研發的RNA原位雜交產品,在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比,RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術,其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端,配以自身級聯放大檢測原理,可以高效敏感地檢測到目標RNA。該技術優勢如下:
1.應用廣泛;
2.高特異性;
3.極高靈敏度,單分子可視化和單細胞定量;
4.兼容降解的RNA樣本;
5.無需RNase-free操作和環境要求,一天完成實驗;
6.檢測結果穩定一致性,兼容高通量自動化平臺;
7.多通道多靶點同時檢測。

(生物谷 bioon.com)

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