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2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀

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摘要:2017年12月31日/生物谷BIOON/---時光總是匆匆而逝,12月份即將結束,2017年也接近尾聲,迎接我們的將是嶄新的2018年,2017年科學家們在CRISPR/Cas研究領域依然取得了許多重磅級的研究成果,本文中小編對2017年CRISPR/Cas研究領域的重磅級亮點研究進行盤點,分享給大家!與各位一起學習!1.Cell:重磅!在哺乳動物體內利用改造的CRISPR/Cas9治療糖尿病、
2017年12月31日/生物谷BIOON/---時光總是匆匆而逝,12月份即將結束,2017年也接近尾聲,迎接我們的將是嶄新的2018年,2017年科學家們在CRISPR/Cas研究領域依然取得了許多重磅級的研究成果,本文中小編對2017年CRISPR/Cas研究領域的重磅級亮點研究進行盤點,分享給大家!與各位一起學習!

1.Cell:重磅!在哺乳動物體內利用改造的CRISPR/Cas9治療糖尿病、急性腎病和肌肉萎縮癥
doi:10.1016/j.cell.2017.10.025
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀 圖片來自Salk Institute。
在一項新的研究中,來自美國沙克生物研究所的研究人員開發出CRISPR/Cas9基因組編輯技術的一種新版本,從而允許他們激活靶基因,同時不會導致DNA斷裂,這就潛在地克服了利用基因編輯技術治療人類疾病的一個重大的障礙。相關研究結果于2017年12月7日在線發表在Cell期刊上,論文標題為“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”。

在初始的CRISPR/Cas9系統中,酶Cas9與指導它靶向到基因組中合適位點上的向導RNA(gRNA)結合在一起,從而在DNA上產生雙鏈斷裂。近期,一些人開始使用Cas9的“死亡”形式(即dCas9):仍然能夠靶向基因組中的特定位點,但是不再切割DNA。相反,dCas9與激活靶基因的轉錄激活結構域(transcriptional activation domain, TAD,起著分子開關的作用)結合在一起。但是由此產生的蛋白---dCas9-TAD---塊頭太大而不適合被包裝到通常用于運送編碼這些蛋白的基因到活體細胞內的腺相關病毒(AAV)載體中。缺乏一種高效的運送系統使得很難在臨床應用中使用這種工具。

為了驗證這種方法,這些研究人員使用了急性腎損傷、1型糖尿病和一種肌肉萎縮癥的小鼠模型。在每種小鼠模型中,他們設計出他們的CRISPR/Cas9系統來增強可能潛在地逆轉疾病癥狀的內源性基因的表達。就急性腎病而言,他們激活兩個已知參與腎臟功能的基因,并觀察到不僅這些基因表達的蛋白水平發生增加,而且這會改善急性腎臟損傷發生之后的腎臟功能。就1型糖尿病而言,他們旨在增強能夠產生β細胞(即一種分泌胰島素的細胞)的基因的活性。這種新方法又一次發揮作用,成功地降低1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。就肌肉萎縮癥而言,他們讓之前已經證實逆轉疾病癥狀的基因表達,包括不能夠很容易地通過傳統的病毒介導的基因療法加以運送的一個特別大的基因。

2.PNAS:重大進展!制定出利用CRISPR/Cas9高效編輯基因組規則
doi:10.1073/pnas.1711979114

科學家們普遍認為,細胞通過隨機地插入一組核苷酸來修復CRISPR/Cas9系統誘導的DNA斷裂。這通常會破壞任何位于發生斷裂的DNA位點處的基因。科學家們已知細胞有時利用供者DNA來修復細胞基因組中的斷裂。然而,這種供者DNA序列本身不會自我插入到細胞基因組中的空白位點上。相反,這種供者DNA的每個末端都存在著一種同源臂(homology arm)以便封閉這種切割造成的空隙。

在一項新的研究中,來自美國約翰霍普金斯大學的研究人員將不同的供者DNA組合插入到人胚胎腎細胞中,這些細胞以其生長良好的能力和經常用于癌癥研究中而為人所知。他們使用攜帶著編碼一種綠色熒光蛋白的基因的供者DNA,當這種基因成功地插入到細胞基因組中時,這種綠色熒光蛋白就會在細胞的核膜上發出綠色熒光。相關研究結果于2017年11月27日在線發表在PNAS期刊上,論文標題為“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。

具體而言,這些研究人員發現長度為33~38nt的同源臂與長度為518nt的同源臂具有相同的編輯成功率,在最佳條件下產生10%~20%的編輯成功率。相反之下,當他們利用長度為15~16nt的同源臂進行測試時,這種基因插入成功率下降了一半。他們在人基因組的三個不同的位點上重復了這些結果。他們還發現新插入的DNA序列能夠長達1000nt(不包括同源臂)。

這些研究人員利用長度為57~993nt的供者DNA序列取得的編輯成功率在10%~50%。更短的供者DNA要比更長的供者DNA取得更高的編輯成功率。比如,長57nt的供者DNA、長714nt的供者DNA和長993nt的供者DNA插入到細胞基因組靶位點上的成功率分別為45.5%、23.5%和17.9%。當長度超過1000nt時,長1122nt的供者DNA和長2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大約為0.5%。

3.Nature:利用CRISPR/Cas9讓小鼠恢復聽力
doi:10.1038/nature25164

Tmc1基因是內耳中檢測聲波的毛細胞發揮正常功能所必需的。攜帶著Tmc1基因的某種顯性突變的人和小鼠經歷著漸進性聽力喪失。在一項新的研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9基因組編輯策略讓這個基因的突變版本失活,從而降低貝多芬小鼠模型中的這種聽力喪失。相關研究結果于2017年12月20日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents”。

在這項新的研究中,美國哈佛大學化學生物學家David Liu和同事們設計出一種向導RNA(gRNA)來特異性地靶向這個基因的常染色體顯性的致病性拷貝。他們不是利用一種基于病毒的系統來運送Cas9和gRNA序列,而是將以一種被稱作Cas9-gRNA復合體的核糖核蛋白(ribonucleotide protein, RNP)封裝在脂質中并進行運送。這種策略改善了這種突變等位基因的編輯選擇性,因此相比于小鼠成纖維細胞培養物中的野生型等位基因,它靶向這種突變等位基因的頻率增加了20倍。

接下來,這些研究人員將脂質包裝的RNP復合體注射到新生的貝多芬小鼠模型(具有一個突變等位基因和一個野生型等位基因)的一只內耳中,并留下一只未接受注射的內耳作為內部對照。這些接受注射的耳朵具有完整的健康的毛細胞,但是未接受注射的耳朵到八周時具有快速的毛細胞死亡。Liu說,“這是激動人心的,這是因為這提示著相比于未接受注射的耳朵,我們能夠讓接受注射的耳朵保持毛細胞健康和豐度。”

這些研究人員通過監控聽覺腦干反應(auditory brainstem response, ABR)來測試四周大的貝多芬小鼠模型的聽力。ABR用于衡量神經元對聲音的反應。未接受注射的耳朵記錄了75~80分貝左右的ABR,與垃圾處理的噪音音量相當。接受注射的耳朵能夠聽到安靜的大約60分貝的聲音,這相當于安靜的談話。盡管這是一種進步,但是野生小鼠能夠聽到低至30~40分貝的聲音,這提示著CRISPR基因組編輯部分上避免了聽力喪失。到8周時,接受注射的耳朵的ABR閾值仍然低于未接受注射的耳朵,但是要高于4周時的ABR閾值,這提示著這些小鼠的聽力繼續惡化。對響亮聲音作出的行為反應在這些接受治療的小鼠和野生小鼠之間遵循著類似的模式。

4.Science:重大突破!利用細菌CRISPR/Cas系統構建出世界上最小的磁帶錄音機
doi:10.1126/science.aao0958
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀 圖片來自Wang Lab/Columbia University Medical Center。
在一項新的研究中,來自美國哥倫比亞大學醫學中心的研究人員通過一些巧妙的分子黑客技術,將一種天然的細菌免疫系統轉化為一種微型數據記錄器,從而為開發將細菌細胞用于疾病診斷和環境監測等用途的新技術奠定基礎。相關研究結果于2017年11月23日在線發表在Science期刊上,論文標題為“Multiplex recording of cellular events over time on CRISPR biological tape”。

這些研究人員對人體腸道中普遍存在的大腸桿菌的一種普通的實驗室菌株進行基因修飾,使得它們不僅記錄與它們與環境之間的相互作用,而且還記錄這些事件發生的時間。

論文通信作者、哥倫比亞大學醫學中心病理學、細胞生物學與系統生物學系助理教授Harris Wang說,“這些被病人吞下的細菌可能能夠記錄它們在整個消化道中經歷的變化,從而對之前無法觀察到的現象產生前所未有的認識。”其他的應用可能包括環境監測,生態學和微生物學領域的基礎研究。

Wang和他的同事們利用很多細菌物種中存在的一種免疫系統---CRISPR-Cas---來構建這種微型數據記錄器。CRISPR-Cas系統復制來自入侵病毒的DNA片段,因此隨后的細菌后代能夠更加有效地抵抗這些病原體。結果就是細菌基因組中的CRISPR位點按時間順序記錄著在病毒感染中存活下來的細菌和它的祖先遭遇到的病毒感染。當這些相同的病毒試圖再次感染時,這種CRISPR-Cas系統能夠識別和消除它們。

5.Nat Biotechnol:重磅!科學家開發出能攜帶CRISPR系統的新型納米顆粒 可實現對細胞基因組的精準編輯
doi:10.1038/nbt.4005

近日,刊登在國際著名雜志Nature Biotechnology上的一篇研究報告中,來自MIT的科學家開發出了一種新型納米顆粒,這種納米顆粒能夠運輸CRISPR基因編輯系統,并對小鼠機體的基因進行特異性修飾;因此研究人員就能夠利用納米顆粒來攜帶CRISPR組分,從而就消除了使用病毒的需要。

利用這種新型的運輸技術,研究者就能對大約80%的肝臟細胞進行特定基因的切割,這或許就能達到目前在成體動物中應用CRISPR技術的最佳成功率。 研究者Daniel Anderson教授說道,讓我們非常激動的是,我們制造了這種特殊的納米顆粒,其能被用來永久特異性地編輯成年動物機體肝細胞中的DNA;本文研究中,研究者所研究的一種名為Pcsk9的基因能調節機體膽固醇的水平,而人類機體中該基因的突變或許和一種名為家族性高膽固醇血癥的罕見疾病有關,目前FDA批準的兩種抗體藥物能夠抑制Pcsk9基因的表達,然而這些抗體藥物需要在患者后半生中定期服用,而新型的納米技術或能永久性地對該基因進行編輯,同時就為治療這種罕見疾病提供了新的治療思路。

6.Science:重磅!CRISPR/Cas9為尋找靶DNA序列的靈活性付出時間代價
doi:10.1126/science.aah7084

在一項新的研究中,來自瑞典烏普薩拉大學的一個研究小組發現被稱為“分子剪刀(molecular scissors)”的CRISPR-Cas9如何能夠在基因組中尋找特定的DNA序列。Cas9已經在生物技術領域有了很多應用,也有望給醫學帶來革命性的變化。這些研究發現表明如何改進Cas9使得這種分子剪刀變得更加快速和更加可靠。相關研究結果發表在2017年9月29日的Science期刊上,論文標題為“Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli”。

這些研究人員開發出兩種新的方法來測量Cas9找到它的靶序列需要多長時間。第一種方法表明Cas9花6個小時的時間搜索細菌基因組(400萬個堿基對)。這種有點不可能的結果也能夠通過第二種獨立的方法加以驗證。所發現的這種時間也與Cas9用來測量每個位點花費的毫秒數(能夠通過實時地追蹤標記的Cas9分子加以測量)相吻合。

Elf說,“這些結果表明Cas9為它的靈活性付出的代價是時間。為了更快速地發現靶序列,需要更多的Cas9分子尋找相同的DNA序列。”

7.Nature:操縱Cas9的REC3結構域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應
doi:10.1038/nature24268
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀
圖片來自Janet Iwasa graphic for Doudna Lab。
在一項新的研究中,來自美國加州大學伯克利分校、麻省總醫院、哈佛醫學院和勞倫斯伯克利國家實驗室的研究人員鑒定出Cas9蛋白中的一個關鍵區域決定著CRISPR-Cas9如何精準地對靶DNA序列進行編輯,對它進行微調可產生超精準的基因編輯器,并且使得該基因編輯器的脫靶切割(off-target cutting)活性降低到有史以來的最低水平。相關研究結果于2017年9月20日在線發表在Nature期刊上,論文標題為"Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy"。論文通信作者為加州大學伯克利分校分子與細胞生物學教授、霍華德-休斯醫學研究所研究員Jennifer Doudna博士。

在CRISPR-Cas9中,Cas9蛋白起著結合和切割DNA的作用。這些研究人員說,他們鑒定出的這種蛋白區域作為DNA切割的一種主控制器發揮作用,是對Cas9進行重新設計進一步提高它的切割精準度的一種顯而易見的靶標。這種方法應當有助科學家們定制設計Cas9變異體,從而使得CRISPR-Cas9在錯誤位點上對DNA進行編輯的幾率最小化。當利用CRISPR-Cas9在人體進行基因治療時,這是一個關鍵的考慮因素。

在當前的這項研究中,Chen和Dagdas利用一種被稱作單分子熒光共振能量轉移(single-molecule FRET, smFRET)的技術準確地測量當Cas9-sgRNA復合物結合到靶DNA上時,這種復合物中的多種蛋白結構域,特別是REC3、REC2和HNH結構域,如何移動。

他們首先確定了eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1提供的特異性益處能夠根據這些Cas9變體中的HNH構象開關的激活閾值要比野生型Cas9蛋白高得多從而使得當結合到脫靶序列上時eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1變體更不可能激活Cas9的切割活性的事實加以解釋。

接著,他們發現REC3結構域負責檢測靶標結合的精準度,隨后這會指示REC2結構域向外旋轉而為HNH核酸酶結構域打開一條通路,從而激活Cas9的切割活性。具有這種活性構象的Cas9隨后能夠切割靶DNA的雙鏈。

Chen、Dagdas和Kleinstiver隨后證實通過讓REC3的部分片段發生突變,就有可能改變Cas9蛋白的特異性,使得HNH核酸酶結構域不會被激活,除非這種sgRNA與靶DNA非常嚴格地匹配。他們能夠設計出一種改進的超精準的Cas9(被稱作HypaCas9),這種HypaCas9保留了它的在靶切割效率,但略微更好地區分人細胞中的在靶位點和脫靶位點。

8.Cell:重大突破!發現一種廣譜的CRISPR/Cas9抑制劑
doi:10.1016/j.cell.2017.07.037

在一項新的研究中,來自美國加州大學伯克利分校、馬薩諸塞大學醫學院、哈佛醫學院和加拿大多倫多大學的研究人員證實兩種Acr蛋白,即AcrIIC1和AcrIIC3,利用不同的策略抑制Cas9。相關研究結果發表在2017年9月7日的Cell期刊上,論文標題為"A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9"。

AcrIIC1是一種廣譜Cas9抑制劑,通過直接結合到Cas9的保守性HNH催化結構域上,阻止多種有差異的Cas9直系同源物切割DNA。AcrIIC1-Cas9 HNH結構域復合體的晶體結構展示了AcrIIC1如何將Cas9限制在一種DNA結合的但是沒有催化活性的狀態。相反,AcrIIC3阻斷單個Cas9直系同源物的活性,誘導Cas9形成二聚體,從而阻止Cas9結合到靶DNA上。

這兩種不同的機制允許獨自地控制Cas9的靶標DNA結合和切割,而且也為開展允許Cas9結合到靶DNA上但阻止它切割DNA的應用鋪平道路。

9.Nature:"基因剪刀"-CRISPR-Cas9變"鈍"為自體免疫病研究提供新啟示
doi:10.1038/nature23875

如今,來自加利福尼亞大學的研究者們利用修飾后的CRISPR系統尋找增強子,這一更新后的工具并不具有基因編輯能力,相反地,它能夠精確地定位增強子存在的區域。根據最近發表在《nature》雜志上的相關結果,來自UCSF的研究者們利用這種叫做CRISPR activation (CRISPRa)的工具成功地找到了調控免疫細胞發育的增強子。這段序列對于自體免疫疾病的發生具有重要的作用。

來自USCF的Jonathan Weissman教授等人開發出的這種叫做"CRISPRa"的技術則能夠對增強子進行精確地激活。與傳統的CRISPR-CAS9技術不同,CRISPRa利用修飾后的Cas9酶與CRISPR聯合使用,能夠在找到特定DNA序列之后進行靶向激活,而非切割。該技術最早是應用于尋找啟動子區域,而這一次研究者們則試圖尋找增強子區域。

具體地,研究者們研究的是一種編碼"IL2RA"的蛋白的基因。該蛋白對于T細胞的功能具有重要的作用。IL-2RA能夠決定T細胞啟動炎癥反應或進行免疫抑制。如果該基因的增強子區域出現故障,那么細胞將難以起到抑制炎癥反應的能力,從而導致自體免疫疾病的發生。

通過對IL2RA上游的DNA序列進行連續篩選,作者發現一段序列對于調控IL2RA的產生具有重要的作用,并最終證明其為IL2RA基因的增強子。

10.Nature:重磅!利用CRISPR–Cas9成功校正人胚胎中的致病性突變
doi:10.1038/nature23305
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀
圖片來自Nature期刊。
近日,關于一個科學家小組首次在美國對活的人胚胎進行基因編輯的消息傳開了。不過,這一成就的細節在當時是粗略的。如今,他們在線發表了他們的結果,揭示出他們成功地校正導致心臟病的MYBPC3基因突變。相關研究結果于2017年8月2日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos”。

美國哈佛大學-麻省理工學院布羅德研究所遺傳學家George Church(未參與這項研究)告訴《科學家》雜志,“這是一個非常重大的里程碑。人們對美國喪失它的優勢感到焦慮不安,這是因為中國正在取得進展。但是這項精心設計的研究僅是花了較長的時間就獲得豐碩的成果。”

2015年,中國科學家們首次報道將CRISPR在人胚胎中使用(Protein & Cell, doi:10.1007/s13238-015-0153-5)。在那項報道下,人胚胎具有阻止它們自己存活的染色體異常。而在這項新的研究中,受精卵是有活力的,它們唯一的麻煩在于遺傳自父本的MYBPC3基因發生僅4個堿基對的小缺失。

11.Science:重大突破!揭示III型CRISPR-Cas系統中的一種環寡腺苷酸信號通路
doi:10.1126/science.aao0100; doi:10.1126/science.aao2210

為了解決這個問題,在一項新的研究中,來自立陶宛維爾紐斯大學的研究人員研究了嗜熱鏈球菌(Sterptococcus thermophilus)III-A型CRISPR-Cas系統中的Cas10(以下稱StCas10)是否具有ATP依賴的催化活性。他們通過生化反應實驗證實在嗜熱鏈球菌Csm(以下稱StCsm)復合物中,Cas10亞基的GGDD基序負責將ATP轉化為一種未知的反應產物X,而且這種反應依賴于Mn2+, Co2+或Zn2+,此外也較低程度地依賴于Mg2+或Fe2+。當然最為關鍵的是,這種反應特別依賴于靶RNA識別和crRNA 5’-柄與靶RNA的3’端側邊序列之間的非互補性。

為了確定反應產物X的身份,這些研究人員利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC和質譜技術證實反應產物X是一種環寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate, cOA)混合物,其中環三腺苷酸(cA3)是主要的產物。這就表明作為對病毒核酸入侵作出的反應,在StCsm復合物中,Cas10亞基的GGDD活性位點催化cOA合成。鑒于基于核苷酸的小分子化合物,如cAMP、cGAMP、p2Gpp、p3Gpp和NAADP,在多種有機體中作為信號分子發揮作用,他們猜測這些cOA也可能是原核生物的抗病毒防御通路中的信號分子。考慮到這些基于核苷酸的信號分子通常結合到傳感蛋白(sensory protein)上,他們也想要鑒定出cOA的傳感蛋白。

為了理解Csm6蛋白在嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas免疫系統中的作用,這些研究人員發現StCsm6和StCsm6’表現出不依賴于金屬離子的單鏈RNA(ssRNA)降解活性,而且這種降解活性依賴于保守的HEPN活性位點上的氨基酸殘基:RXXXXH。顯著的是,它們的ssRNA降解活性是較弱的,僅在較高的蛋白濃度(微摩爾范圍)下才是明顯的。他們猜測StCsm復合物產生的cOA可能作為StCsm6和/或StCsm6’的CART結構域的配體發揮作用。他們首先證實cOA混合物顯著地增加StCsm6和StCsm6’的單鏈RNA酶活性,降低所需的蛋白濃度大約1000倍,而且它們不能夠降解雙鏈RNA(dsRNA)和單鏈DNA(ssDNA),這意味著它們是ssRNA特異性的核酸酶。此外,通過開展一系列實驗,他們證實StCsm6和StCsm6’的CARF結構域作為StCsm復合物產生的cOA配體的傳感蛋白發揮作用。

為了確定哪種cOA是StCsm6和StCsm6’的激活物,這些研究人員開展核酸酶測試,結果揭示出在所有測試過的cOA中,僅cA6(環六腺苷酸)激活StCsm6和StCsm6’的RNA酶活性。有趣的是,是cA4(環四腺苷酸)而不是cA6激活TtCsm6的RNA酶活性。在相同的反應條件下,線性的寡腺苷酸并不激活StCsm6或TtCsm6。這似乎表明cOA是多種III型CRISPR-Cas系統中通用的信號分子。這一發現提示著Csm6/Csx1和與Csm/Cmr復合物結合的其他CARF家族蛋白可能是由cOA調節的。

我們的DNA上的自然差異可能通過抑制Cas9切割合適的基因靶標或者任何一種靶標的能力,降低CRISPR對人類基因組進行精準編輯的能力。詳細地分析這個問題的嚴重程度,可能對基因組編輯技術如何在臨床試驗中進行測試和它們是否能夠被廣泛地使用產生影響。這種分析的結果于2017年7月31日在線發表在Nature Medicine期刊上,論文標題為“Implications of human genetic variation in CRISPR-based therapeutic genome editing”。

在這項新的研究中,布羅德研究所的David Scott和Feng Zhang分析了來自外顯子組集合聯合(Exome Aggregation Consortium, ExAC)和千人基因組(1,000 Genomes, 1000GP)數據庫的數據,結果發現DNA差異顯著地影響Cas9等RNA引導的核酸內切酶的作用效果。ExAC和1000GP數據庫收錄了人類基因變異方面的數據。

作為這項研究的一部分,Scott和Zhang研究了針對與影響大腦、腎臟、膽固醇和血管生長等的疾病相關聯的12個基因設計的單個向導RNA(gRNA)。依賴于基因上存在的人基因組特征,這些gRNA的脫靶位點數量位于0到10000多個之間。

Zhang和Scot說,GUIDE-seq和CIRCLE-seq等篩選策略能夠在全基因組范圍內揭示RNA引導的核酸酶的脫靶切割活性,應當被用來準確地找到針對特定疾病的最佳的gRNA-核酸酶組合。

12.PNAS:首次利用CRISPR-Cas9對古生菌進行基因組編輯
doi:10.1073/pnas.1618596114

在一項新的研究中,來自美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的微生物學教授Bill Metcalf和博士后研究員Dipti Nayak首次記錄了在古生菌(Archaea,也譯作古細菌,或古菌)中使用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯。他們的突破性工作有潛力在未來極大地加快研究這類有機體,包括對全球氣候變化的影響。相關研究結果于2017年3月1日在線發表在PNAS期刊上,論文標題為“Cas9-mediated genome editing in the methanogenic archaeon Methanosarcina acetivorans”。

Nayak解釋道,“在大多數情形下,作為我們的模式古生菌,乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)的倍增時間是8到10小時,而大腸桿菌能夠在大約30分鐘內增殖一倍。這意味著進行遺傳學研究和獲得突變體能夠需要數月時間,而同樣的事情在大腸桿菌中開展僅需三天。在通常情況下,CRISPR-Cas9能夠讓我們做的事情就是加快這整個過程。它解決了一個重大的瓶頸:在這種古生菌中開展遺傳學研究。再者,利用我們之前的技術,必須一步一步地引入突變。利用這種新的技術,我們能夠同時引入多種突變。我們能夠利用CRISPR指數級地擴大這個突變體產生過程。”

為了在細胞中使用CRISPR系統,研究人員必須開發出一種將細胞偏好的DNA修復系統考慮在內的操作方法:在CRISPR“分子剪刀”切割染色體后,細胞的修復系統介入進來,通過一種能夠被用來移除或添加附加的遺傳物質的機制修復這種DNA損傷。在真核細胞中,這種修復機制為非同源末端連接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)。盡管這種機制用于CRISPR介導的基因組編輯中,但是它往往在修復過程中產生遺傳錯誤:作為DNA梯子中的橫檔,核苷酸經常在切割位點上被加入或移除。

NHEJ機制在包括古生菌在內的原核生物中是非常罕見的;相反,它們的DNA損傷更多的時候是通過一種被稱作同源重組修復(homology-directed repair, HDR)的機制加以修復的。通過將DNA損傷與一種DNA模板進行比較,HDR機制獲得一種“確定性的模板”,其最終結果能夠被提前預測,并且能夠按照研究人員的需要加以精確地調整。

Nayak解釋道,在很多方面,HDR機制確實適合于基因組編輯:“由于NHEJ的存在,我們想要在真核生物中利用CRISPR-Cas9進行定向編輯。就這點而言,大多數古生菌菌株并沒有NHEJ機制倒是個好消息,因此,它們的唯一能夠修復DNA的途徑就是這種確定性的同源修復機制(即HDR)。”

盡管看起來似乎違反直覺,Nayak和Metcalf的首批CRISPR-Cas9應用之一就是在乙酸甲烷八疊球菌中引入NHEJ機制。Nayak說,盡管通常不大適合用于基因組編輯,但是NHEJ也有優于HDR機制的地方:“如果你僅想要移除一個基因,如果不在乎如何移除...,那么NHEJ機制實際上更加高效。”

Nayak說,通過這種引入的NHEJ修復系統開展基因敲除研究,即單個基因被移除或沉默以便觀察會產生什么變化和這個基因可能影響哪些過程,未來的研究將能夠組裝出乙酸甲烷八疊球菌和其他的古生菌物種的基因圖譜。

13.Science:從結構上揭示CRISPR/Cas系統的Cas1-Cas2整合酶發現靶DNA機制
doi:10.1126/science.aao0679
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀
蛋白IHF(藍色)在CRISPR短回文重復序列的上游產生一種個急轉彎,從而允許Cas1-Cas2(綠色和黃色)識別和結合插入位點。圖片來自Addison Wright, UC Berkeley。
在一項新的研究中,來自美國加州大學伯克利分校的研究人員發現Cas1-Cas2如何找出它們將病毒DNA片段插入到細菌基因組中的這個位點,這樣Cas1-Cas2隨后就能夠識別這種病毒DNA片段和發起攻擊。相關研究結果于2017年7月20日在線發表在Science期刊上,論文標題為“Structures of the CRISPR genome integration complex”。

論文通信作者Jennifer Doudna和她的研究團隊利用電子顯微技術和X射線晶體分析技術捕獲到Cas1-Cas2將病毒DNA片段插入到細菌基因組的CRISPR區域中時的結構圖。

這些結構圖揭示出第三種蛋白IHF(在Cas1-Cas2整合酶中,Cas1是第一種蛋白,Cas2是第二種蛋白)結合到這個插入位點的附近,讓靶DNA彎曲成一種U形結構,從而允許Cas1-Cas2同時結合到靶DNA的兩個末端上。

14.Nature:重大突破!發現III型CRISPR-Cas系統新的作用機制
doi:10.1038/nature23467

在一項新的研究中,瑞士蘇黎世大學的Martin Jinek領導的一個國際研究團隊史無前例地發現細菌保護自己免受侵入性病毒攻擊的一種新的防御機制。當遭受入侵時,作為細菌免疫系統的CRISPR-Cas系統產生一種化學信號來激活第二種酶,從而協助降解這些入侵者的遺傳物質。這一過程非常類似于人先天性免疫系統的一種抗病毒機制。相關研究結果于2017年7月19日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“Type III CRISPR–Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers”。

CRISPR-Cas系統的這種靶向復合物由源自規律間隔性成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的RNA序列(即crRNA)和CRISPR相關蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)組成。crRNA識別入侵性病毒的遺傳物質,而Cas蛋白像一把分子剪刀那樣切割它。在CRISPR-Cas系統的一個亞型(被稱作III型CRISPR-Cas系統)中,該團隊取得一項令人吃驚的發現。當這種靶向復合物識別入侵性病毒時,它合成“第二種信使”:一種小的環狀RNA分子,即環寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate)。這種信號分子能夠在細菌細胞內擴散,激活另一種被稱作Csm6的RNA降解酶,這種RNA降解酶協助破壞這種病毒的RNA。

15.Nature:從結構上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向機制
doi:10.1038/nature22398

在一項新的研究中,來自丹麥哥本哈根大學的研究人員發現了一種新的被稱作Cpf1的分子剪刀如何讓DNA解鏈,并對它進行切割。這個CRISPR-Cas家族成員表現出較高的準確性,能夠像全球定位系統(GPS)那樣發揮作用以便鑒定出基因組中的靶位點。Cpf1的高精準度將會改進這種技術在修復基因損傷、其他醫學應用和生物技術應用上的使用。

這些研究人員成功地可視化觀察和描述了Cpf1的工作方式。這種蛋白屬于Cas家族,能夠切割雙鏈DNA,因而允許啟動這種基因組修飾過程。相關研究結果發表在2017年6月22日的Nature期刊上,論文標題為“Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage”。論文通信作者為哥本哈根大學研究員Guillermo Montoya和Stefano Stella。

全世界的科學家們正在努力優化這種基因組編輯技術以便讓它變得更加精準和更加高效。為了實現這一點,科學家們也關注特異性地切割DNA的其他蛋白,如Cpf1,對這些蛋白進行操縱能夠將它們引導到基因組中的特定位點上。Montoya團隊利用X射線衍射晶體分析技術成功地解析出控制這種過程的分子機制。

Montoya說,“我們利用X射線照射Cpf1蛋白晶體,能夠在原子分辨率上觀察到它的結構,從而能夠讓我們觀察它的所有組分。X射線衍射是被用來解析生物分子結構的主要生物物理學技術之一。”

16.Cell:重大突破!首次從結構上揭示CRISPR-Cas3系統作用機制
doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

在一項新的研究中,來自美國哈佛醫學院和康奈爾大學的研究人員獲得來自嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的I型CRISPR復合體的近原子分辨率的圖片,揭示出它的作用機制的關鍵步驟。這些發現提供改善CRISPR在生物醫學應用時的效率和準確性所需的結構數據。相關研究結果發表在2017年6月29日的Cell期刊上,論文標題為“Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System”。論文通信作者為哈佛醫學院細胞生物徐助理教授Maofu Liao和康奈爾大學研究員Ailong Ke。

這些研究人員利用冷凍電子顯微鏡技術首次描述出當這種CRISPR復合體裝載靶DNA并讓它做好被Cas3酶切割的準備時準確發生的一系列事件。他們說,這些結構揭示出一種存在多層錯誤檢測的過程,即存在阻止不想要的基因組損傷的分子冗余(molecular redundancy)。

為了更好地理解CRISPR-Cas如何發揮功能,Liao、Ke和他們的團隊著重關注細菌中最常見的CRISPR亞型:1型CRISPR,即利用一種被稱作CRISPR Cascade的核糖蛋白復合體(riboprotein complex)捕獲DNA,并且利用酶Cas3切割外源DNA。

通過聯合使用生化技術和冷凍電子顯微鏡技術,他們復原出在不同的功能狀態下的穩定的Cascade,并且進一步獲得Cascade在捕獲和加工DNA時分辨率低至3.3埃(大約是一個碳原子直徑的3倍)的圖片。

17.Cell:中科院生物物理所王艷麗/章新政課題組從結構上揭示Cas13a切割RNA機制
doi:10.1016/j.cell.2017.06.050
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀
圖片來自Cell期刊。
作為一種VI-A型CRISPR-Cas系統的一種RN引導的RNA核酸酶,Cas13a降解crRNA靶向的入侵性RNA,在RNA技術中具有廣泛的潛在應用。 如今,在一項新的研究中,為了理解Cas13a如何被激活和切割靶RNA,中科院生物物理所中國科學院核酸生物學重點實驗室創新課題組組長王艷麗(Yanli Wang)課題組和中科院生物物理所生物大分子國家重點實驗室創新課 題組組長章新政(Xinzheng Zhang)課題組解析出來自口腔纖毛菌(Leptotrichia buccalis)的Cas13a(以下稱LbuCas13a)結合到crRNA和它的靶RNA上時的晶體結構,以及LbuCas13a-crRNA復合物的冷凍電鏡結構。他們證實 crRNA-靶RNA雙鏈結合到LbuCas13a中的核酸酶葉(nuclease lobe, NUC)的一種帶正電荷的中心通道內,而且一旦結合靶RNA,LbuCas13a和crRNA經歷顯著的構象變化。這種crRNA-靶RNA雙鏈形成促進LbuCas13a的HEPN1結 構域移向HEPN2結構域,從而激活LbuCas13a的HEPN催化位點,隨后LbuCas13a就以一種非特異性的方式切割單鏈靶RNA和其他的RNA。

這些發現揭示出VI型CRISPR-Cas系統的Cas13a抵抗RNA噬菌體的作用機制,這就為將它作為一種RNA操縱工具加以應用鋪平道路,如將它的RNA切割和附帶切割活性用于基礎研究、診斷和治療。

18.CRISPR專利爭奪者再放大招!Nature、Cell兩篇文章發現10種用于疾病診斷的CRISPR酶
doi:10.1016/j.molcel.2017.04.008; doi:10.1038/nature19802

最近來自加利福尼亞大學的研究人員通過研究描述了10種新型的CRISPR酶,這些酶一旦被激活其行為就像“吃豆人”一樣能夠“嚼碎”RNA,因此這些酶類或許能作為診斷傳染性病毒的敏感檢測器。這種新型的酶類是CRISPR蛋白—Cas13a的突變體,去年9月,來自伯克利的研究人員利用該蛋白實現了對來自病毒RNA的特異性序列進行檢測,同時研究者表示,一旦CRISPR—Cas13a同其靶點RNA相結合后,其就會開始切割RNA,從而就能夠輕松切掉和受體分子相關的RNA,并且產生熒光幫助研究者進行信號檢測。

此前來自博德研究所的兩個研究小組相繼對CRISPR—Cas13a和RNA進行配對,并將構建好的新系統命名為SHERLOCK系統,該系統能夠在極低濃度下對病毒的RNA進行檢測,比如對登革熱和寨卡病毒的RNA進行檢測等。諸如這種系統就能夠用來檢測任何類型的RNA,包括癌細胞特異性的RNA。

當伯克利和博德研究所的研究人員發現使用的原始的Cas13a酶僅能夠在特定核苷酸位點(尿嘧啶)對RNA進行切割時,本文中研究者發現了其中三種新型的Cas13a突變體則能夠在腺嘌呤位點切割RNA,這種差異性就能夠實現同時檢測兩種不同的RNA分子,比如來自兩種不同病毒的RNA。研究者Alexandra East-Seletsky表示,我們通過深入研究發現了具有不同核苷酸的Cas13a家族的其它同系物,這就能夠對攜帶紅色和綠色熒光信號的不同受體分子進行同時檢測,從而幫助研究者開發多通道的酶類檢測系統。

研究者East-Seletsky表示,把Cas13a與RNA靶點結合看作一種開關,靶向作用該開關就能夠開啟酶類的表達使其成為細胞中的“吃豆人”來切割附近的RNA分子。發表在Nature雜志上的研究報告中,伯克利的研究人員討論了CRISPR—Cas13a所具有的活性是否能在細菌中扮演關鍵角色,從而幫助細菌殺滅感染性的病毒或噬菌體,作為一些細菌的部分免疫系統組分,CRISPR—Cas13a能夠促進感染的細胞自殺從而幫助抵御其它細菌細胞免于被感染,類似的非CRISPR自殺細菌在其它其中中也存在。

隨后研究人員對細菌基因組數據庫進行搜尋,發現了10個其它的Cas13a樣蛋白,隨后研究者對這些蛋白進行了合成,并且評估其切割RNA的能力,其中有7個蛋白類似原始的Cas13a,另外3個則能夠對RNA進行切割。基于前期的研究結果,研究人員表示,他們或許能夠多元化地使用這些酶類,并且擴展該技術的使用范圍,CRISPR-Cas13a家族或許還有其它多種用途,比如進行RNA檢測等。最后研究者Doudna說道,我們未來的研究目的就是開發用于多個醫療點診斷的強大Cas13a酶類家族。

19.Nat Biotechnol:利用CRISPR表觀基因組編輯鑒定人基因組中的功能性調節元件
doi:10.1038/nbt.3853

大多數DNA并不編碼蛋白。了解這種基因組“暗物質”如何和何時在基因調節的何處發揮作用是一個巨大的任務。如今,科學家們開發出的一種工具可能提供幫助。在一篇于2017年4月3日在線發表在Nature Biotechnology期刊上的論文中,來自美國杜克大學的研究人員描述了一種高通量篩選技術:利用CRISPR-Cas9表觀基因組編輯鑒定人細胞基因組中的調節元件。這篇論文的標題為“CRISPR–Cas9 epigenome editing enables high-throughput screening for functional regulatory elements in the human genome”。論文通信作者為來自杜克大學的Gregory E Crawford、Timothy E Reddy和Charles A Gersbach。

研究結果證實導致更常見的復雜疾病(如心血管疾病、糖尿病和神經系統疾病)的大多數基因變異實際上發生于基因之間的調節區域。令人興奮的事情是有方法對非編碼基因組的功能進行標注。

Gersbach和同事們構建出靶向兩個感興趣的基因位點β-globin和HER2周圍的幾百萬個堿基中的潛在調節元件的向導RNA(gRNA)文庫。他們隨后產生整合著熒光蛋白的細胞系,其中這種熒光蛋白指示靶基因激活。

這些研究人員將核酸酶活性已被滅活的兩種Cas9蛋白版本(被稱作dCas9)--- dCas9抑制版本(dCas9KRAB)和dCas9激活版本(dCas9p300)---中的一種導入到他們產生的細胞系中。dCas9KRAB招募讓組蛋白H3K9發生甲基化的蛋白,從而導致異染色質形成和靶序列上的基因抑制。dCas9p300結合到靶DNA增強子或啟動子上,促進組蛋白H3K27發生乙酰化,從而導致基因激活。

接下來,這些研究人員將較低水平的gRNA文庫導入到他們產生的細胞系中以便確保單個gRNA存在于每個細胞中。他們隨后基于熒光分選這些細胞,并且對存在于發生特別高水平和低水平靶基因表達的細胞中的gRNA進行測序。

序列鑒定印證了已知的調節元件,并且揭示出其他的DNA序列的新作用。很多這些序列(盡管不是所有序列)出現在dCas9KRAB篩選和dCas9p300篩選中。一些序列似乎對一種細胞類型中的基因發揮著調節作用,但是對另一種細胞類型中的相同基因并不會起著調節作用。盡管這些觀察到的基因表達變化是微妙的,但是這些研究人員證實了單個DNA序列的調節作用。

20.Nature:“武林高手”細菌CRISPR系統VS病毒,以快為尊
doi:10.1038/nature21719
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀
CRISPR與DNA片段,大腸桿菌。圖片來自Mulepati, S., Bailey, S.; Astrojan/Wikipedia/CC BY 3.0。
CRISPR是一種細菌免疫系統。它也是一種強大的基因組編輯工具。在與病毒的斗爭當中,打響的第一槍通常是注射。想要感染細菌的病毒刺入細菌細胞的保護性細胞壁,注入它自己的遺傳密碼。如今,來自美國洛克菲勒大學的一項新的研究揭示出細菌如何利用CRISPR快速地抵抗這種到來的威脅。這一發現解答了一個由來已久的CRISPR如何發揮作用的難題。相關研究結果于2017年3月29日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“CRISPR–Cas systems exploit viral DNA injection to establish and maintain adaptive immunity”。

科學家們已經了解的基礎事實是:當細菌細胞被病毒DNA入侵時,它的CRISPR系統捕獲病毒的DNA片段(即間隔序列),并對這些DNA片段進行登記。一旦相同的病毒再次入侵,這種CRISPR系統就快速地識別它。

論文通信作者、洛克菲勒大學細菌學實驗室主任Luciano A. Marraffini說,“大約10年來,我們已知道CRISPR系統通過獲取病毒DNA片段發揮作用,但是在CRISPR免疫系統中這種關鍵的步驟在感染期間何時發生仍然是個謎。”他研究當地細菌中的CRISPR系統。

為了闡明這種時間安排,Marraffini和他的團隊設計實驗:在不同的時間點上阻止病毒生命周期。博士后研究員Joshua W. Modell和研究生Wenyan Jiang隨后研究了CRISPR系統以便觀察它何時和如何獲得來自病毒的間隔序列(spacer)。

并不是任何病毒DNA都對CRISPR有用。之前的研究已證實,它偏好來自DNA松散末端的間隔序列。這種偏好縮小了它的選擇,這是因為病毒DNA僅在感染的某些時間點采取線性形式,而在它的感染的剩余時間,它的DNA兩個末端連接在一起,形成一種環形結構。

Marraffini團隊在三個時間點上阻止這種病毒感染。但是不論他們在何時阻斷這種感染,CRISPR持續地獲得間隔序列,這表明它從一開始,也就是在病毒注射它的基因組到細菌細胞中的時候,就獲得它們。

這種時間安排比較重要。通過從病毒首先注入細菌細胞中的DNA末端獲得間隔序列,CRISPR確保一旦這種感染下次再次出現,它就攻擊這種病毒。當Marraffini團隊改變CRISPR系統使得它含有與病毒最后注入細菌細胞中的DNA末端相匹配的間隔序列時,病毒仍然能夠增殖。

21.Cell:重磅!揭示抗CRISPR蛋白阻斷CRISPR系統機制
doi:10.1016/j.cell.2017.03.012

想象一下細菌和病毒一直處于軍備競賽之中。對很多細菌而言,一種抵抗病毒感染的防御線是一種復雜的RNA引導的“免疫系統”,即CRISPR-Cas。這個免疫系統的核心是一種識別病毒DNA和觸發它破壞的監視復合物。然而,病毒能夠反擊,利用抗CRISPR蛋白讓這種監視復合物不能夠發揮功能。但是,在此之前,沒有人準確地知道這些抗CRISPR蛋白如何發揮作用。

如今,來自美國國家過敏癥與傳染病研究所、斯克里普斯研究所、蒙大拿州立大學、加州大學舊金山分校和加拿大多倫多大學的研究人員首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附著到一種細菌CRISPR監視復合物上時的結構。他們發現抗CRISPR蛋白的作用機制是封鎖CRISPR識別和攻擊病毒基因組的能力。一種抗CRISPR蛋白甚至“模擬”DNA,讓這種crRNA(CRISPR經轉錄產生的RNA)引導的檢測機器脫軌。相關研究結果發表在2017年3月23日的Cell期刊上,論文標題為“Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex”。論文通信作者為來自斯克里普斯研究所的Gabriel C. Lander和來自蒙大拿州立大學的Blake Wiedenheft。

利用一種被稱作冷凍電鏡的高分辨率成像技術,這些研究人員發現了CRISPR系統和抗CRISPR蛋白的三個重要的方面。

首先,他們準確地觀察這種CRISPR監視復合物如何識別病毒遺傳物質以便發現它應當在何處發起攻擊。這種監視復合物中的蛋白像握手那樣纏繞在細菌crRNA的周圍,讓這種crRNA的特定片段暴露出來。這種特定片段掃描病毒DNA,尋找它們能夠識別的基因序列。再者,這些研究人員分析了病毒抗CRISPR蛋白如何癱瘓這種監視復合物。他們發現一種抗CRISPR蛋白覆蓋住crRNA的這個暴露片段,從而阻止這種CRISPR系統掃描病毒DNA。

另一種抗CRISPR蛋白采用一種不同的策略。基于這種抗CRISPR蛋白的結合位置和負電荷,這些研究人員認為它起著模擬DNA的作用,誘導CRISPR結合這種抗CRISPR蛋白,而不是入侵的病毒DNA。

這些研究人員認為這種對抗CRISPR蛋白的新認識可能最終導致人們開發出更加復雜的和更加高效的基因編輯工具。抗CRISPR蛋白可能能夠被用于CRISPR系統之中來迅速阻斷基因編輯,或者科學家們可能能夠降解抗CRISPR蛋白來觸發基因編輯。

22.Science:基于CRISPR/Cas13a的診斷平臺可檢測任何RNA分子,靈敏度增加一百萬倍
doi:10.1126/science.aam9321

在一項新的研究中,來自美國哈佛大學-麻省理工學院布羅德研究所(以下簡稱布羅德研究所)、麻省理工學院麥戈文腦研究所、麻省理工學院醫學工程與科學研究所、哈佛大學懷斯生物啟發工程研究所(Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering)的研究人員將一種靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相關酶(即Cas13a)改造為一種快速的、廉價的和高度靈敏的診斷工具,從而有潛力引發研究和全球公共衛生變革。相關研究結果于2017年4月13日在線發表在Science期刊上,論文標題為“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在這項研究中,布羅德研究所成員Feng Zhang、Jim Collins、Deb Hung、Aviv Regev和Pardis Sabeti描述了這種靶向RNA的CRISPR相關酶如何被用作一種高度靈敏的檢測器---能夠指示最少至一個靶RNA或DNA分子的存在。論文第一作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg將這種新的工具稱為“SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)”;這種技術可能有朝一日被用來應對病毒性和細菌性流行病爆發、監控抗生素耐藥性和檢測癌癥。

在2016年6月,Zhang和他的同事們首次描述了這種靶向RNA的CRISPR相關酶(之前被稱作C2c2,如今被稱作Cas13a),而且能夠經編程后切割細菌細胞中的特定RNA序列(Science, Published online:02 Jun 2016, doi:10.1126/science.aaf5573)。不同于靶向DNA的CRISPR相關酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a能夠在切割它的靶RNA之后保持活性,而且可能表現出不加區別的切割活性,而且在一系列被稱作“附帶切割(collateral cleavage)”的作用當中,繼續切割其他的非靶RNA。在其發表的論文和申請的專利中,該團隊描述了這個CRISPR系統的廣泛生物技術應用,包括將它的RNA切割和附帶切割活性用于基礎研究、診斷和治療。

在這項新的研究中,這種SHERLOCK方法的靈敏度增加了一百萬倍。這種增加是由于Zhang團隊和布羅德研究所成員Jim Collins合作開展研究取得的結果。Collins之前一直在研究寨卡病毒的診斷方法(Cell, 19 May 2016, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059)。在2014年,Collins和他在懷斯生物啟發工程研究所的團隊開發出一種快速的基于合成紙的埃博拉病毒測試方法,該方法所使用的試劑能夠在室溫下運輸和儲存。他們隨后對這種測試系統進行修改來檢測寨卡病毒,并且證實他們能夠通過加入低水平熱量來提高RNA在樣品中的濃度來提高這種系統的檢測靈敏度。 通過一起合作,Zhang團隊和Collins團隊能夠采用一種不同的依賴體溫的擴增過程來提高他們的測試樣品中的DNA或RNA水平。一旦這種水平增加,他們利用第二個擴增步驟將DNA轉化為RNA,從而使得他們將這種靶向RNA 的CRISPR工具的靈敏度增加了一百萬倍,而且這種工具能夠在幾乎任何環境下使用。

另外,這種CRISPR工具還包括一種RNA報告分子。當該報告分子被切割時,它會發出熒光。當Cas13a檢測到靶RNA序列時,它的無區分的RNA酶活性(即附帶切割活性)也會切割這種RNA報告分子,從而釋放可檢測到的熒光信號。

23.Nat Biotechnol:首次利用CRISPR培育出單核苷酸編輯轉基因小鼠
doi:10.1038/nbt.3816

人類DNA由大約30億個核苷酸組成。在某些情形下,僅一個核苷酸發生變化就能夠導致嚴重的疾病。科學家們希望利用一個正確的核苷酸替換這個不正確的核苷酸,從而治愈這些疾病。然而,利用當前的基因編輯工具CRISPR-Cas9替換單個核苷酸存在技術上的挑戰。如今,在一項新的研究中,來自韓國基礎科學研究所(Institute for Basic Science, IBS)基因組工程中心的研究人員利用這種流行的基因編輯技術CRISPR-Cas9的一種變體版本培育出單核苷酸編輯小鼠。相關研究結果于2017年2月27日在線發表在Nature Biotechnology期刊上,論文標題為“Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos”。

作為近年來出現的一種卓有成效的基因編輯技術,CRISPR-Cas9的作用機制是在DNA雙鏈中的一個發生突變的核苷酸附近進行切割,切除一小段DNA序列。相反,IBS研究人員采用Cas9蛋白的一種變體:切口酶Cas9(nickase Cas9, nCas9),同時讓Cas9與一種被稱作胞苷脫氨酶(cytidine deaminase, CD)的蛋白融合在一起。CRISPR-nCas9-CD能夠將一種核苷酸替換另一種核苷酸,因而也被稱作堿基編輯器(Base Editor)。2016年,美國哈佛大學的David Liu團隊和日本神戶大學的Keiji Nishda團隊已開發出這種類型的脫氨酶,并且在體外培養的細胞系中進行過測試。IBS研究人員通過將這種技術用于小鼠胚胎中,進一步推動它的發展。

IBS研究人員在小鼠體內測試了CRISPR-nCas9-CD是否能夠校正Dmd基因(編碼抗肌萎縮蛋白)或Tyr基因(編碼酪氨酸酶)中的單個核苷酸。他們在這兩種基因中都取得成功:由Dmd基因發生單核苷酸突變的胚胎發育而成的小鼠在它們的肌肉中不產生抗肌萎縮蛋白(dystrophin),而Tyr基因發生單核苷酸突變的小鼠表現出白化性狀。抗肌萎縮蛋白確實與肌肉肌營養不良疾病相關聯,而酪氨酸酶控制黑色素產生。

再者,這兩種單核苷酸替換僅出現靶位點上。這是比較重要的,這是因為它表明僅靶位點上的突變核苷酸遭受替換。論文通信作者、IBS基因組工程中心主任KIM Jin-Soo陳述道,“我們首次證實可編程的脫氨酶在小鼠胚胎中高效地誘導核苷酸替換,從而培育出具有疾病表型的突變小鼠。這是一項概念驗證實驗。下一個目標是在動物中校正基因缺陷。最終,這種技術可能允許在人類胚胎中進行基因校正。”

24.Nature:利用CRISPR/Cas9構建出更加強效的CAR-T細胞
doi:10.1038/nature21405
2017年度巨獻:CRISPR/Cas重磅級研究TOP25解讀

在一項新的研究中,來自美國斯隆凱特林癌癥紀念中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的研究人員利用CRISPR/Cas9的力量構建出更加強效的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor CAR)T細胞(CAR-T細胞),從而增強小鼠體內的腫瘤免疫排斥。這一出于意料的發現揭示出CAR免疫療法的一些細節,并且突出展現了利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術推動癌癥免疫療法的潛力。

CRISPR/Cas9是一種基因組編輯工具,能夠讓科學家們精確地切割和操縱細胞中的DNA。在這項新的研究中,這些研究人員證實CRISPR/Cas9技術能夠運送CAR基因到T細胞基因組中的特定位點上。這種精準的方法能夠更強健地構建出CAR-T細胞---它們能夠持續更長的時間地殺死腫瘤細胞,這是因為它們更不容易耗竭。這可能潛在地導致在病人體內更加安全地和更加高效地使用這種強大的免疫療法。

論文通信作者、斯隆凱特林癌癥紀念中心基因轉移與基因表達實驗室科學家Michel Sadelain博士說,“癌細胞總是無休止地試圖躲避治療,因此我們需要能夠制造出與它們相匹配的并且比它們活得更長的CAR-T細胞。這一新的發現證實我們可能能夠利用基因組編輯的力量內在地改進這些‘活細胞療法’。我們迫切地持續探究基因組編輯技術如何可能給我們提供下一代CAR-T細胞療法。”

25.Cell:中科院解析VI型CRISPR-Cas系統C2c2-RNA復合物結構
doi:10.1016/j.cell.2016.12.031

1月12日,Cell 雜志發表了中科院生物物理研究所王艷麗課題組關于Ⅵ型CRISPR-Cas系統的效應蛋白C2c2的結構研究。標題為“Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities”。該研究解析了Leptotrichia shahii(Lsh)細菌中C2c2與crRNA (CRISPR-RNA) 的二元復合物以及C2c2在自由狀態下的晶體結構,揭示了LshC2c2通過兩個獨立的活性結構域來發揮其兩種不同的RNA酶切活性,這為研究C2c2發揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。

2015年,一種全新的第二類CRISPR-Cas系統-Ⅵ型系統被發現,該系統中的效應蛋白被命名為C2c2。而后的研究進一步發現,Ⅵ型CRISPR-Cas系統是一種新型靶向RNA的CRISPR系統,而C2c2是一種以RNA為導向靶向和降解RNA的核酸內切酶,有望被開發作為RNA研究的工具,擴展CRISPR系統在基因編輯方面的運用。

王艷麗課題組通過深入的研究,解析了C2c2與crRNA的二元復合物的晶體結構以及C2c2蛋白的晶體結構,揭示了C2c2包含一個crRNA識別的葉片即REC葉片,和一個核酸酶葉片即NUC葉片。REC葉片包含NTD結構域(N-terminal domain)和Helical-1結構域,NUC葉片包含了兩個HEPN結構域、Helical-2結構域以及連接兩個HEPN結構域的連接結構域。負責切割前體crRNA和靶標 RNA的活性口袋分別位于Helical-1和HEPN結構域上。crRNA的結合會引起C2c2蛋白的構象變化,這種變化很可能會穩定crRNA的結合,進而對識別靶標RNA起著重要作用。該研究通過結構和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶標 RNA的分子機制,對認識細菌抵抗RNA病毒入侵的分子基礎具有十分重要的意義。同時也為改造CRISPR-C2c2系統,為其在基因編輯領域的運用提供了強有力的結構基礎,有助于加速對病毒感染引發的疾病的理解、治療和預防。(生物谷 Bioon.com)

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