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實習醫生日記之頑固失眠

實習醫生日記之頑固失眠

今日去我院某教授跟門診,有一位中年女性患者因“反復失眠20余年”來就診。在此之前我并不知道真正意義上的熊貓眼,不過今日可真的見識到了,特拍了一張照片:

實習醫生日記之—妊娠劇吐

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劉某,女,32歲,第一次懷孕,停經已12周。該患者停經的第九周開始出現惡心嘔吐,開始時嘔吐尚不多,3-5次每天。后來嘔吐逐漸加重,7-8次每天,嘔不能食,嘔出食物及黃膽水。

實習醫生日記之豬蹄腳

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組成 黃芪10克,黨參(或太子參)10克,丹參10克,炒白術10克,薏苡仁15克,仙鶴草15克,白花蛇舌草15克,甘草5克。功能 益氣活血,健運脾胃。主治 適用于治療慢性萎縮性胃炎,或伴有腸上皮化生等

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2017年12月CRISPR/Cas亮點盤點

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摘要:年月日生物谷基因組編輯技術被科學雜志列為年年度十大科技進展之一受到人們的高度重視是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱是相關蛋白的簡稱最初是在細菌體內發現的是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統即將過去的月份有哪些重大的研究或
2017年12月31日/生物谷BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一,受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱,Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的,是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統。

即將過去的12月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢?小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞,供大家閱讀。

1.Science子刊:利用CRISPR/Cas9有望治療漸凍人癥
doi:10.1126/sciadv.aar3952
2017年12月CRISPR/Cas亮點盤點 圖片來自Chris Bickel/AAAS。
肌萎縮性脊髓側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS),又稱路格里克氏病(Lou Gehrig’s disease),或者漸凍人癥,是一種致命性的神經退行性疾病。ALS影響了大約2萬名美國人,其特征在于腦干和脊髓中運動神經元的過早死亡。這種疾病引起漸進性肌肉惡化并最終導致癱瘓和死亡。還沒有可用的治療方法來延緩肌肉萎縮,目前已被批準的藥物最多能夠延長存活幾個月的時間。

根據一項新的研究,CRISPR-Cas9基因編輯能夠延長ALS小鼠模型的存活。相關研究結果發表在2017年12月20日的Science Advances期刊上,論文標題為“In vivo genome editing improves motor function and extends survival in a mouse model of ALS”。

Schaffer和他的同事猜測ALS可能通過基因組編輯來加以治療,這是因為這種疾病的某些形式(約20%的遺傳性ALS病例,占全部ALS病例的2%)是由編碼超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因發生顯性突變引起的。SOD1是一種有助保護細胞免受毒性自由基攻擊的酶。

這些研究人員以ALS小鼠模型中為研究對象,利用一種病毒載體將一種能夠穿過脊髓進入受影響的運動神經元細胞核的病毒載體,將一種旨在切割SOD1基因的Cas9蛋白的編碼基因運送到這些小鼠中。

相比于未接受治療的小鼠,這些接受過治療的小鼠經歷著總體的癥狀改善---疾病發作延遲37%和存活期增加了25%。它們比未接受治療的小鼠(具有大約四個月的壽命)多存活大約一個月的時間。

2. Nature:利用CRISPR/Cas9讓小鼠恢復聽力
doi:10.1038/nature25164

Tmc1基因是內耳中檢測聲波的毛細胞發揮正常功能所必需的。攜帶著Tmc1基因的某種顯性突變的人和小鼠經歷著漸進性聽力喪失。在一項新的研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9基因組編輯策略讓這個基因的突變版本失活,從而降低貝多芬小鼠模型中的這種聽力喪失。相關研究結果于2017年12月20日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents”。

在這項新的研究中,美國哈佛大學化學生物學家David Liu和同事們設計出一種向導RNA(gRNA)來特異性地靶向這個基因的常染色體顯性的致病性拷貝。他們不是利用一種基于病毒的系統來運送Cas9和gRNA序列,而是將以一種被稱作Cas9-gRNA復合體的核糖核蛋白(ribonucleotide protein, RNP)封裝在脂質中并進行運送。這種策略改善了這種突變等位基因的編輯選擇性,因此相比于小鼠成纖維細胞培養物中的野生型等位基因,它靶向這種突變等位基因的頻率增加了20倍。

接下來,這些研究人員將脂質包裝的RNP復合體注射到新生的貝多芬小鼠模型(具有一個突變等位基因和一個野生型等位基因)的一只內耳中,并留下一只未接受注射的內耳作為內部對照。這些接受注射的耳朵具有完整的健康的毛細胞,但是未接受注射的耳朵到八周時具有快速的毛細胞死亡。Liu說,“這是激動人心的,這是因為這提示著相比于未接受注射的耳朵,我們能夠讓接受注射的耳朵保持毛細胞健康和豐度。”

這些研究人員通過監控聽覺腦干反應(auditory brainstem response, ABR)來測試四周大的貝多芬小鼠模型的聽力。ABR用于衡量神經元對聲音的反應。未接受注射的耳朵記錄了75~80分貝左右的ABR,與垃圾處理的噪音音量相當。接受注射的耳朵能夠聽到安靜的大約60分貝的聲音,這相當于安靜的談話。盡管這是一種進步,但是野生小鼠能夠聽到低至30~40分貝的聲音,這提示著CRISPR基因組編輯部分上避免了聽力喪失。到8周時,接受注射的耳朵的ABR閾值仍然低于未接受注射的耳朵,但是要高于4周時的ABR閾值,這提示著這些小鼠的聽力繼續惡化。對響亮聲音作出的行為反應在這些接受治療的小鼠和野生小鼠之間遵循著類似的模式。

3.Cell:重磅!在哺乳動物體內利用改造的CRISPR/Cas9治療糖尿病、急性腎病和肌肉萎縮癥
doi:10.1016/j.cell.2017.10.025
2017年12月CRISPR/Cas亮點盤點 圖片來自Salk Institute。
在一項新的研究中,來自美國沙克生物研究所的研究人員開發出CRISPR/Cas9基因組編輯技術的一種新版本,從而允許他們激活靶基因,同時不會導致DNA斷裂,這就潛在地克服了利用基因編輯技術治療人類疾病的一個重大的障礙。相關研究結果于2017年12月7日在線發表在Cell期刊上,論文標題為“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”。

在初始的CRISPR/Cas9系統中,酶Cas9與指導它靶向到基因組中合適位點上的向導RNA(gRNA)結合在一起,從而在DNA上產生雙鏈斷裂。近期,一些人開始使用Cas9的“死亡”形式(即dCas9):仍然能夠靶向基因組中的特定位點,但是不再切割DNA。相反,dCas9與激活靶基因的轉錄激活結構域(transcriptional activation domain, TAD,起著分子開關的作用)結合在一起。但是由此產生的蛋白---dCas9-TAD---塊頭太大而不適合被包裝到通常用于運送編碼這些蛋白的基因到活體細胞內的腺相關病毒(AAV)載體中。缺乏一種高效的運送系統使得很難在臨床應用中使用這種工具。

為了驗證這種方法,這些研究人員使用了急性腎損傷、1型糖尿病和一種肌肉萎縮癥的小鼠模型。在每種小鼠模型中,他們設計出他們的CRISPR/Cas9系統來增強可能潛在地逆轉疾病癥狀的內源性基因的表達。就急性腎病而言,他們激活兩個已知參與腎臟功能的基因,并觀察到不僅這些基因表達的蛋白水平發生增加,而且這會改善急性腎臟損傷發生之后的腎臟功能。就1型糖尿病而言,他們旨在增強能夠產生β細胞(即一種分泌胰島素的細胞)的基因的活性。這種新方法又一次發揮作用,成功地降低1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。就肌肉萎縮癥而言,他們讓之前已經證實逆轉疾病癥狀的基因表達,包括不能夠很容易地通過傳統的病毒介導的基因療法加以運送的一個特別大的基因。

4.JCI:重磅!科學家有望開發出根治兒童神經細胞瘤的新型療法
doi:10.1172/JCI90793

日前,一項刊登在國際雜志Journal of Clinical Investigation上的研究報告中,來自美國博德研究所和達納-法伯癌癥研究所的研究人員通過聯合研究發現一種間接方法來對抗神經細胞瘤誘發的關鍵遺傳損傷。

相比成人腫瘤而言,兒童癌癥常常擁有相對“安靜”的基因組,兒童癌癥中基因突變較少,尤其是一些容易用作開發新藥的靶點(比如蛋白激酶等),這些腫瘤更易于出現其它類型的遺傳改變,比如基因重復或異位等。這種情況通常發生出現在高危神經細胞瘤中,神經細胞瘤是一種罕見的兒童神經腫瘤,患者機體中通常會出現MYCN基因的頻繁放大,其主要會促進腫瘤細胞過量產生轉錄因子,即能夠有效關閉和開啟基因表達的特殊蛋白,而研究人員常常很難直接對其進行靶向作用。

這項研究中,研究人員通過研究發現了MYCN放大的神經細胞瘤中潛在的藥物開發靶點,即癌細胞對EZH2的生存依賴性,EZH2是MYCN的一個作用靶點,其能夠幫助有效控制細胞身份和行為等多個方面。研究人員利用基因組尺度的CRISPR篩查數據來闡明神經細胞瘤靶點的最初列表,在該列表中,EZH2和其兩個生化配偶體:EED和SUZ12的特點比較明顯。

利用信息學、基因和藥理學實驗,研究人員對細胞系和動物模型進行了深入研究,結果表明:1)MYCN蛋白能夠直接控制EZH2的表達;2)EZH2蛋白能夠阻斷細胞中腫瘤抑制基因的表達,同時抑制其生長成為成熟的神經元細胞,神經母細胞瘤細胞看起來和非成熟的神經細胞非常相似;3)在體外和體內實驗中,利用RNA干擾技術或藥物來沉默EZH2的表達能夠有效損傷神經細胞瘤的生長。

5.PNAS:不同患者的機體基因組或會影響基因編輯療法的有效性和安全性
doi:10.1073/pnas.1714640114

目前,基因編輯技術已經開始在臨床試驗中進行測試了,研究人員能利用CRISPR-Cas9和其它技術來直接對人類機體細胞的DNA進行編輯,多項臨床試驗都處于招募受試者或計劃階段;近日,一項刊登在國際雜志PNAS上的研究報告中,來自波士頓兒童醫院及蒙特利爾大學的研究人員就通過研究發現,個體與個體之間的遺傳差異或許會削弱基因編輯產生的效率,在更罕見的情況下或許會造成潛在的危險的“脫靶”效應。

本文研究增加了一些新證據,即基因編輯或許需要適應每個病人的基因組,從而才能夠確保被靶向作用的基因或附近DNA序列中不會出現突變。醫學博士Stuart Orkin說道,人類的DNA序列并不相同,而且被認為是“正常”的DNA序列或許也并不能解釋所有的差異;在設計治療性編輯的靶向系統時我們推薦需要將常見的變異考慮在內,同時也為了能最大限度地發揮功效,減少患者潛在的安全隱患。

文章中,研究者對此前已經發布的7444個全基因組序列進行分析,基于研究人員比較感興趣通過基因編輯來改變的30個疾病相關的DNA靶點列表,研究人員就制成了一張含有幾乎3000個導向RNAs(gRNAs)的列表,當然這些只是被開發出的遺傳代碼的一部分,其能夠直接直接指導CRISPR-Cas9酶進入到靶點附近合適的編輯位點。隨后研究人員向通過研究觀察是否這7444名個體機體的gRNAs中會攜帶DNA序列的改變。

研究者Canver解釋道,如果CRISPR試劑能夠用于治療的這個位點存在一定的遺傳差異,那么你可能面臨治療效率降低或療法失敗的風險;單個堿基對的差異或許會導致結合效率的降低,而這歸因于導向RNA的錯配,總而言之,或許就會引發患者療法效率的下降。研究者發現,在基因組中出現這種現象并不罕見,大約有50%被分析gRNAs都會被靶點位置的突變體潛在影響;此外,在一些新的病例中研究者還發現,促進基因組中DNA序列與gRNA更好匹配的遺傳突變或許會潛在地將DNA序列“拖動”到錯誤位置,從而就會使得基因或其它DNA區域不會被靶向作用。

6.PNAS:重大進展!制定出利用CRISPR/Cas9高效編輯基因組規則
doi:10.1073/pnas.1711979114
2017年12月CRISPR/Cas亮點盤點圖片來自Alexandre Paix。
科學家們普遍認為,細胞通過隨機地插入一組核苷酸來修復CRISPR/Cas9系統誘導的DNA斷裂。這通常會破壞任何位于發生斷裂的DNA位點處的基因。科學家們已知細胞有時利用供者DNA來修復細胞基因組中的斷裂。然而,這種供者DNA序列本身不會自我插入到細胞基因組中的空白位點上。相反,這種供者DNA的每個末端都存在著一種同源臂(homology arm)以便封閉這種切割造成的空隙。

在一項新的研究中,來自美國約翰霍普金斯大學的研究人員將不同的供者DNA組合插入到人胚胎腎細胞中,這些細胞以其生長良好的能力和經常用于癌癥研究中而為人所知。他們使用攜帶著編碼一種綠色熒光蛋白的基因的供者DNA,當這種基因成功地插入到細胞基因組中時,這種綠色熒光蛋白就會在細胞的核膜上發出綠色熒光。相關研究結果于2017年11月27日在線發表在PNAS期刊上,論文標題為“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。

具體而言,這些研究人員發現長度為33~38nt的同源臂與長度為518nt的同源臂具有相同的編輯成功率,在最佳條件下產生10%~20%的編輯成功率。相反之下,當他們利用長度為15~16nt的同源臂進行測試時,這種基因插入成功率下降了一半。他們在人基因組的三個不同的位點上重復了這些結果。他們還發現新插入的DNA序列能夠長達1000nt(不包括同源臂)。

這些研究人員利用長度為57~993nt的供者DNA序列取得的編輯成功率在10%~50%。更短的供者DNA要比更長的供者DNA取得更高的編輯成功率。比如,長57nt的供者DNA、長714nt的供者DNA和長993nt的供者DNA插入到細胞基因組靶位點上的成功率分別為45.5%、23.5%和17.9%。當長度超過1000nt時,長1122nt的供者DNA和長2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大約為0.5%。

7.美國食品藥品管理局提醒不要隨便嘗試編輯自己的基因

國外的奧丁公司銷售基因編輯相關的產品,并且在網上發布基因編輯操作流程的視頻。而且,根據該公司的網站的介紹,它提供了48種與基因編輯相關的產品,價格在10美元~1699美元 美國食品藥品管理局(FDA)在看到這個視頻后,發表聲明指出市場上出現的基因編輯產品屬于非法的產品,這些產品的安全性并未在長時間的臨床試驗中受到證實,因此建議公眾不要輕信這些產品。

8.首個CRISPR產品將于2018年進行β-地中海貧血I/II期臨床試驗

2017年12月7日,CRISPR 治療公司(CRISPR Therapeutics)宣布提交CTX001用于β-地中海貧血治療的臨床試驗申請(clinical trial application, CTA)。CTX001是一種開展過CRISPR基因編輯的實驗性自體造血干細胞療法,旨在用于治療患有β-地中海貧血和鐮狀細胞病的患者。

CRISPR 治療公司首席執行官Samarth Kulkarni博士評論說:“本公司正在開發一種新型藥物,CTX001是首個開展CRISPR基因編輯療法的臨床試驗產品。我們致力于將CRISPR平臺的突破性科學成果轉化為臨床治療,從根本上提高患有β-地中海貧血和鐮狀細胞病等嚴重疾病的患者的生活質量。”

CTX001的I/II期臨床試驗旨在評估其在成人輸血依賴性β-地中海貧血患者中的安全性和有效性,預計將于2018年在歐洲開始。該公司還計劃2018年向美國食品藥品管理局(FDA)提交CTX001治療鐮狀細胞疾病的臨床研究申請(investigational new drug, IND)。(生物谷 Bioon.com)

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