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實習醫生日記之頑固失眠

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非編碼RNA之piRNA最新研究進展

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摘要:年月日生物谷互作是近年來新發現的一類小分子主要在生殖細胞系中表達對于維持生殖系完整抑制轉座子轉錄抑制翻譯參與異染色質的形成執行表觀遺傳調控和生殖細胞發生等均有重要作用過去的研究表明生殖細胞特異性表達的家族蛋白是作用途徑的中心為生物生成及功能所必需小鼠家族包括
2017年10月31日/生物谷BIOON/---Piwi互作RNA(piRNA)是近年來新發現的一類小RNA分子,主要在生殖細胞系中表達,對于維持生殖系DNA完整、抑制轉座子轉錄、抑制翻譯、參與異染色質的形成、執行表觀遺傳調控和生殖細胞發生等均有重要作用。過去的研究表明,生殖細胞特異性表達的PIWI家族蛋白是piRNA作用途徑的中心,為piRNA生物生成及功能所必需。小鼠PIWI家族包括MILI、MIWI和MIWI2三個成員,特異性地在睪丸中表達,對小鼠精子發生至關重要。
非編碼RNA之piRNA最新研究進展 圖片來自黃雪梅,張守濤,王 芳,劉 偉,張一折. piRNA:一類新的非編碼小RNA. 中國生物工程雜志。
piRNA發現于2006年,在動物生殖細胞系中它與特定蛋白一同束縛轉座子。這種蛋白- RNA的組合形成了一個分子防御系統,科學家們將其比作基因組的免疫系統。與免疫系統相似,piRNA系統能夠區分敵我,啟動應答,并且去適應新出現的入侵者。這些基因組衛士們還能夠記住曾經入侵的轉座子。在進化過程中piRNA的復雜性曾經歷了爆炸式增長,科學家們認為人體內的piRNA總共可能有數百萬種。

目前的研究表明,piRNA主要存在于哺乳動物的生殖細胞和干細胞中,通過與Piwi亞家族蛋白結合形成piRNA復合物(piRC)來調控基因沉默途徑。piRNA在沉默基因轉錄過程、維持生殖系和干細胞功能以及調節翻譯和mRNA的穩定性等功能中發揮著重要的作用。

1.Nature:顛覆常規!揭示細胞產生piRNA新機制
doi:10.1038/nature23482
非編碼RNA之piRNA最新研究進展 維持動物基因組完整性的一種重要的通路是piRNA通路。piRNA通路在生殖細胞中是有活性的,而且利用被稱作piRNA的小片段RNA互補性地結合到自私基因的轉錄本上,因而利用與piRNA結合的Argonaut蛋白啟動沉默。奧地利科學院分子生物技術研究所(IMBA)的Julius Brennecke實驗室一直在果蠅中利用前沿的下一代測序技術積極地探究這些基于RNA的自我防御機制。piRNA的來源位于基因組中含有自私DNA序列的沉默區域。這種組裝便產生一種進化中的“先有雞還是先有蛋”困境:piRNA如何能夠由它們沉默的基因組區域產生?

在一項新的研究中,Brennecke實驗室不僅解決了這個謎團,而且也描述了一種全新的基因表達機制。相關研究結果于2017年8月23日在線發表在Nature期刊上,論文標題為“A heterochromatin-dependent transcription machinery drives piRNA expression”。

這種新發現的通路圍繞著一種被稱作Moonshiner的蛋白。Moonshiner蛋白是一種基礎轉錄因子的同源蛋白,與Rhino蛋白相互作用。Rhino是一種結合到自私基因的異染色質上的蛋白。Rhino蛋白將Moonshiner蛋白招募到這種異染色質區域,隨后Moonshiner蛋白啟動催化轉錄的RNA聚合酶II-前起始復合物(RNA polymerase II pre-initiation complex)組裝。因此,在原本沉默的基因組區域中的基因表達是通過一種嵌入在組蛋白標記而不是在DNA序列中的不同代碼進行激活的。這些發現表明piRNA轉錄違背了經典的基因激活規則,涉及將標準的基因激活與基因沉默組合在一起。

2.Cell:重大突破!鑒定出剪切piRNA前體的核酸酶Trimmer
doi:10.1016/j.cell.2016.01.008

生殖細胞中有一類小RNA阻止其基因組發生不需要的基因重寫。在一項新的研究中,來自日本東京大學的一個研究小組鑒定出一種被稱作Trimmer的酶,該酶參與這類小RNA的產生。相關研究結果發表在2016年2月25日那期Cell期刊上,論文標題為“Identification and Functional Analysis of the Pre-piRNA 3'Trimmer in Silkworms”。

“跳躍基因”或者說轉座子是一小段DNA序列,能夠在基因組中移動。它們能夠破壞宿主基因,而且也參與癌癥和其他疾病的產生。因此,有機體需要持續控制它們,特別是在產生精子和卵子的生殖細胞中以便確保后代的基因組完整性。在生殖細胞中,這是通過一類被稱作piRNA(PIWI-interacting RNA,與PIWI蛋白相互作用的RNA)的小RNA來實現的。這些piRNA通常長24~30個核苷酸,能夠抑制跳躍基因表達。piRNA被認為是通過剪切它們的序列更長的前體(pre-piRNA)的3'末端而形成的。然而,負責這種剪切過程的酶仍然未知。

在這項研究中,東京大學分子與細胞生物科學研究所的Natsuko Izumi助理研究員和Yukihide Tomari教授及其同事們成功地在桑蠶卵巢細胞中將一種之前未曾描述過的核糖核酸酶確定為剪切蛋白Trimmer。他們的數據證實Trimmer不能單獨發揮作用:它需要Papi---一種PIWI相關蛋白---的配合來剪切pre-piRNA的3'末端。再者,他們證實剪切這些pre-piRNA的3'末端在piRNA的功能中發揮著重要作用,而且可能是在線粒體的表面上發生的。

3.Cell Res:劉默芳等發現小鼠粗線期piRNA在精子發育中的重要功能
doi:10.1038/cr.2014.41
非編碼RNA之piRNA最新研究進展 國際學術期刊Cell Research 于5月2日在線發表了中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所劉默芳研究組關于小鼠粗線期piRNA指導精子形成后期mRNA大規模清除的最新研究成果。

不同于卵子含有大量母源mRNA和蛋白質支持早期胚胎發育,成熟精子中僅殘留微量的mRNA,但目前還不清楚精子細胞中大量的mRNA是如何在形成精子前被大規模降解清除的。piRNA 是新近在動物生殖系細胞中發現的一類與PIWI家族蛋白相互作用的小分子非編碼RNA,在哺乳動物的精子發生過程先后出現兩次表達高峰,分別被稱為前粗線期piRNA與粗線期piRNA。目前對在早期生精細胞中表達的前粗線期piRNA的作用已有所了解,而在減數分裂前后大量表達的粗線期piRNA的功能還鮮為人知;粗線期piRNA的功能機制是領域當前普遍關注的前沿熱點。

劉默芳研究組茍蘭濤博士、研究生戴鵬和中山大學楊建華博士等共同發現,在小鼠延長形精子細胞中,粗線期piRNA與其結合蛋白MIWI、脫腺苷酸酶CAF1組成pi-RISC復合物,通過堿基不完全配對方式識別靶mRNA 3非翻譯區(3¢UTR)的序列元件、誘導靶mRNA脫腺苷酸及降解;依賴于piRNA百萬級數量的不同序列,pi-RISC介導了精子細胞發育后期數千不同mRNA的降解。這一研究工作不僅提供了精子形成后期mRNA大規模降解的分子機制,同時揭示了粗線期piRNA在精子發育中的重要功能,并證明piRNA除了沉默轉座子外,還參與調控編碼基因。

4.Dev. Cell:解析piRNA作用通路
doi:10.1016/j.devcel.2012.12.006

來自中科院上海生命科學研究院的研究人員近日在新研究中證實,piRNA在精子發生后期通過APC/C觸發了MIWI泛素化及MIWI/piRNA機器清除。這一研究發現對于深入了解piRNA作用通路在哺乳動物精子發生中的功能機制具有重要意義。相關論文發布在1月14日的《發育生物學》(Developmental Cell)雜志上。

在這篇文章中,研究人員證實小鼠PIWI (MIWI)是通過APC/C-26S蛋白酶體信號通路進行降解,piRNAs通過促進MIWI與一種APC/C底物結合亞基的互作在這一過程中發揮了至關重要的作用。有趣的是,研究人員發現在晚期精細胞中piRNA觸發的MIWI破壞,轉而導致了piRNA消除,這揭示了一條在特定的發育階段調節性清除MIWI/piRNA機器的前饋機制。重要的是,研究人員發現適當清除MIWI/piRNA是精子成熟的必要條件。

這些結果表明piRNAs通過泛素-蛋白酶體信號通路調控了MIWI/piRNA機器的清除,證實在雄性生殖細胞發育過程中適當的時序調控MIWI/piRNA具有非常重要的意義。

5.Science:基因組衛士piRNA的故事
doi:10.1126/science.339.6115.25

與絕大多數動物一樣,人類基因組不少都來自于一種自私的DNA鏈——轉座子。這類遺傳物質能夠在染色體不同位點間跳躍,導致基因失活甚至引發癌癥。在生殖細胞系中,轉座子的跳躍還可能導致不孕。“對于絕大多數動物來說,無法控制轉座子都會最終導致物種滅絕,”麻省大學醫學院的生化遺傳學家Phillip Zamore說。

正因如此,一類特殊的RNA分子(piRNA)就成了動物基因組的大英雄。piRNA發現于2006年,在動物生殖細胞系中它與特定蛋白一同束縛轉座子。這種蛋白- RNA的組合形成了一個分子防御系統,科學家們將其比作基因組的免疫系統。與免疫系統相似,piRNA系統能夠區分敵我,啟動應答,并且去適應新出現的入侵者。這些基因組衛士們還能夠記住曾經入侵的轉座子。在進化過程中piRNA的復雜性曾經歷了爆炸式增長,科學家們認為人體內的piRNA總共可能有數百萬種。

近年來,研究人員開始慢慢理解piRNA約束轉座子的機制,但人們依然不了解細胞制造piRNA的過程,也不清楚這些RNA在生殖細胞系以外還有何功能。Zamore指出,在哺乳動物中piRNA沉默轉座子只是其功能的一小部分,盡管這也是人們目前唯一了解的部分。2012年前后piRNA研究領域開啟了令人興奮的新時代,該領域的重要成果紛紛登上Science、Nature、Cell等頂尖雜志。本期Science雜志就對近來的piRNA研究進行了系統性總結和展望。

6.Bioinformatics:動物所piRNA的高精度預測算法研究獲得突破
doi:10.1093/bioinformatics/btr016

中國科學院動物研究所康樂研究組的張屹等最近發表的題為A k-mer scheme to predict piRNA and characterize locust piRNA 的最新研究論文,解決了高精度預測生物體中數量最大的一類非編碼RNA---piRNA的難題,論文發表在生物信息學權威期刊《生物信息學》(Bioinformatics,IF=4.926)上。

這篇文章中提出了一種基于k-mer串頻率的Fisher判別式來預測piRNA的算法, 精度達90%以上,超過了哈佛大學B. Doron的61%的精度。利用該方法,他們成功地鑒定出飛蝗8萬多條piRNA,預測飛蝗可能存在約13萬條piRNA。進一步分析發現,這些piRNA在飛蝗群居型和散居型間存在巨大差異,這可能為解釋飛蝗兩型生殖力差異提供了重要的線索。

這個不依賴基因組數據來鑒定非模式生物piRNA的新方法具有重要的理論意義和廣泛的應用價值。目前,在線軟件piRNApredictor (http://59.79.168.90/piRNA/index.php) 已被國外科研機構用于豬的piRNA研究中。

7.Nature:新型小分子RNA-piRNA被發現 掀起新一輪小RNA熱
doi:10.1038/nature04917

小分子RNA聯合Argonaute蛋白作為一種序列特異性的指引來調節信使mRNA的穩定性、蛋白的合成、染色質的組構和基因組的結構。在動物中,Argonaute蛋白分為兩種亞家族:與RNA干涉相關和利用長度為21-22個核苷酸的RNA序列進行microRNA介導的基因調控相關的亞家族;而Piwi亞家族與生殖細胞特異性事件相關,例如保養生殖干細胞和減數分裂。然而,Piwi蛋白的生物化學功能和它指導小分子RNA的機理并不為人所知。在文章中,我們展示了老鼠的Piwi蛋白——MIWI與一類之前未曾描述的在]睪丸中富含的29–30核苷酸的RNA相結合的結果。我們因此把這些與Piwi蛋白相作用的RNA稱為piRNAs。piRNAs在基因組中顯示出與眾不同的定位類型,主要成群地分為長20–90kb的基因簇,其中的長片斷的小分子RNA只能來源于單鏈。相似的piRNAs在人類和小鼠中均有發現,大部分基因簇出現在同一染色體的位置上。雖然piRNA的功能仍然需要研究闡明,但是生殖細胞中的piRNA富集現象和Miwi突變導致的男性不育表明piRNA在配子形成的過程中起作用。

在各種不同的基因沉默過程中,小分子RNA與Argonaute蛋白結合來識別部分或者全部的序列互補的核酸靶標。Argonaute蛋白的一種亞家族——Piwi蛋白家族,為無脊椎動物的精子和干細胞的發育所必需。兩種Piwi蛋白家族成員:MILI 和MIWI是小鼠精子形成所必需的。在文章中,我們描述了一類與小鼠雄性精子細胞的MILI蛋白結合的新型小分子RNA,這些小分子RNA在減數分裂起始期積累。所確證的這些1,000多條獨特小分子RNA序列均具有強的5'尿嘧啶偏愛性,否則,就不能容易地將這些序列分類成一個家族。這些小分子RNA的遺傳圖譜顯示了數量有限的基因簇,表明這些小分子RNA由較長的初級轉錄產物加工而成。這些小分子RNA的長度為26–31個核苷酸。明顯與21–23個核苷酸的microRNAs和短siRNAs不同。因此我們稱其為“Piwi相互作用RNA”或者piRNAs。直系同源(Orthologous)的人類染色體區域也能產生具有piRNAs特性的小分子RNA,但序列不相同。該類新型小分子RNA的證實為確定哺乳動物中精子形成過程中的Piwi蛋白的作用提供了起點。

8.Science:發現新一類基因沉默的小RNA—piRNA
doi:10.1126/science.1130164

編碼性的小RNA調節著一些對細胞生長和發育必需的過程,包括mRNA降解,翻譯抑制,轉錄階段基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)。在哺乳動物中尋找造成TGS的因子過程里,作者純化出一個含有小RNA和Riwi(老鼠中的人類Piwi的同源物)。這些RNA,長度通常在29-30nt,被稱為與Piwi相互作用作用的piRNA復合物的(piRC)制備物中含有rRecQ1,其中rRecQ1是脈孢菌(Neurospora) qde-3基因表達蛋白的同源物,該基因參與沉默途徑作用。Piwi在蒼蠅里就已與TGS在遺傳上聯系起來,也與純化的piRNA復合物的具有切割活性的共分級分離(cofractionate)物聯系。這些結果就與piRC中存在著一個基因沉默作用相一致。該研究成果已經發表在06年06月15日的《Science》雜志的網絡版Sciencexpress上。

通過將制備的老鼠睪丸粗提物進行離子交換Q柱分離,分成流出物和洗脫物兩部分,同時監控小RNA,構建cDNA文庫后進行測序,發現流出物中的RNA主要是microRNA(miRNA),洗脫物中的RNA(69%)主要是從那些平常被認為不能表達的基因組區域獲得的,長度大多在25-31nt,而且Northern印跡分析也顯示出一個睪丸特異性的特征。大多數的洗脫物中RNA5’端大多以尿苷開始(約84%),但沒有特征性序列或基序被檢測到。而且,在洗脫物中RNA觀察到一個明顯的亞群體(subpopulation)長度在29-30nt,然而它們與洗脫物中的其他的RNA無論是在5’核苷,基因組上的位點,還是注釋上都不能去區別開來。因此,所有洗脫出的RNA不能與已經注釋的非編碼性的RNA(miRNA, tRNA, rRNA, snRNA)配備,而一起被認為代表著新鑒定出的一類小RNA。

隨后又通過五步的實驗程序純化與這類小RNA作用的蛋白,質譜結果鑒定出老鼠中存在人類Piwi和RecQ1蛋白的同源物(分別稱為Riwi和rRecQ1)。Western印跡結果也證實Riwi和rRecQ1與這些小RNA共純化。因此,作者將這類小RNA命名為與Piwi相互作用的RNA(piRNA),并將與老鼠Piwi同源物一起形成的復合物稱為piRNA復合物。

人類的RecQ1是一個ATP依賴性的DNA解旋酶,它的ATPase和DNA解旋活性在piRC中的rRecQ1蛋白也存在。Riwi含有催化性的氨基酸殘基,這些殘基在其他的Ago家族蛋白中被用來進行RNA指導的靶標RNA切割。通過使用與piRNA互補的底物,也能檢測到切割活性,尤其是在含有Riwi和piRNA的組分中活性最高,然而,活性不強健,這可能是不同piRNA組成的總體中相關的piRNA所占比重較小(〈0.2%)的緣故。

Piwi蛋白代表著Ago蛋白家族中的一個分支(subclade),首次在在果蠅(Drosophila)中發現,起著調節生殖干細胞維持的作用。隨后也發現哺乳動物的Piwi蛋白成員調節著生殖細胞的成熟。piwi基因突變的果蠅在小RNA依賴性的轉基因和逆轉座子沉默上存在缺陷,同時也喪失了異染色質蛋白的。四膜蟲(Tetrahymena) Piwi (TIWI)對siRNA調節的DNA降解是必需的。

9.Science:線蟲piRNAs的功能、靶點和進化
doi:10.1126/science.1220952
非編碼RNA之piRNA最新研究進展 2012年6月14日,Science雜志在線報道了線蟲piRNAs研究最新進展。Piwi-相互作用RNA(piRNAs)是維持生殖細胞系完整性和可育性所必須的一類小分子RNA,但其作用機制尚不明確。

本研究證實,線蟲piRNAs以不完全互補的方式,反式沉默轉錄物的表達。這種靶向性沉默,是不依賴于Piwi核酸內切酶活性或剪切的。相反,piRNAs引發了一種局限性二級內源小干擾RNA(endo-siRNA)反應。內源蛋白編碼基因和轉座子轉錄物在與piRNAs互補的位點發生Piwi依賴的endo-siRNA反應。而Piwi的突變則可解除這種抑制。piRNAs生物合成的基因組位點缺乏蛋白編碼基因,且常與轉座子的起始和末端序列分別以有義或反義方式重疊。

該研究結果提示,線蟲類piRNA基因簇是為抵抗移動性DNA元件而進化出來的。由此,piRNA在線蟲體內提供了可遺傳的,序列特異性RNAi的驅動因子。

10.Nature:林海帆小組-piRNAs在基因調控中發揮重要作用
doi:10.1038/nature06263

來自杜克大學醫學院細胞生物學系,耶魯大學醫學院耶魯干細胞中心及細胞生物學系的研究人員發現了不同于已知的表觀遺傳沉默中的Piwi和RNA介導的沉默途徑的功能——他們識別出了果蠅中12,903個piRNAs(Piwi-interacting RNAs ),并描述了其特征,首次提出piRNAs在基因功能調控方面扮演著重要角色。這一研究成果公布在《自然》雜志上。

在這篇文章中,研究人員識別出了果蠅中12,903個Piwi作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,piRNAs),并描述了其特征,認為rasiRNAs屬于piRNAs的一個亞集。同時研究人員也發現Piwi能促進染色體3的右臂上次尾端(subtelomeric)異染色質(也稱為端粒相關序列,TAS,即全稱為3R-TAS)上常染色質組蛋白修飾,以及piRNA的轉錄。

進一步研究發現piwi突變型中3R-TAS失去了常染色體組蛋白修飾,而且3R-TAS1 piRNA和3R-TAS上一種whiter受體基因的表達也受到了抑制。而P element插入到3R-TAS1piRNA編碼序列下游的128堿基對位置則可以逆轉3R-TAS的常染色體組蛋白修飾,以及piwi突變型中3R-TAS1piRNA的表達。

這些研究說明Piwi促進了3R-TAS異染色質中常染色質特性,以及其轉錄活性,這不同于已知的表觀遺傳沉默中的Piwi和RNA介導的沉默途徑的功能,研究人員也指出這些活性功能也許是通過3R-TAS1piRNA相互作用獲得,而且對于生殖干細胞(germline stem-cell)的維持是必要的。(生物谷 Bioon.com)

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