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原生生物使宿主免受腸道細菌感染

字號:T|T|T
摘要:眾所周知腸道微生態的組成十分復雜它對個體的生長發育營養物質代謝疾病等方面都有重要的作用很多研究表明腸道微生物與癌癥肥胖免疫疾病等相關今天小編將與大家分享一篇今年月發表在上的文章題目是

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

眾所周知,腸道微生態的組成十分復雜,它對個體的生長發育、營養物質代謝、疾病等方面都有重要的作用,很多研究表明腸道微生物與癌癥、肥胖、免疫疾病等相關。今天,小編將與大家分享一篇今年10月發表在Cell上的文章,題目是“Host-Protozoan Interactions Protect from Mucosal Infections through Activation of the Inflammasome”,即“原生生物與宿主之間的相互作用,能激活炎癥小體從而使得宿主免受細菌感染”。接下來我們就一起來看看這篇有趣的文章吧!


SUMMARY:

脊椎動物體內的原生生物對宿主的影響及其對粘膜免疫內環境穩態的作用仍然不清楚。本文展示了一種新發現的原生動物---小鼠三毛滴蟲(T.musculis/T.mu),這種原生動物能激活宿主上皮細胞的炎癥體并誘導IL-18釋放。上皮細胞所分泌的IL-18能誘導樹突狀細胞,驅動Th1及Th17相關的免疫反應,從而保護宿主腸道粘膜免受細菌感染。盡管T.musculis起到類似原生動物抗生素的作用,但作者發現它的定植會加劇T細胞相關的結腸炎以及散發的結直腸腫瘤。作者展示了一種新的宿主與原生生物相互作用,這種作用能增強粘膜的宿主防御能力,但同時要承擔更高的炎癥性疾病的風險。


INTRODUCTION:

哺乳動物腸道中有許多微生物群體,包括病毒、原核微生物、真核微生物等。其中真核微生物包括無數的真菌、蠕蟲、原生生物。研究表明一些原生生物是鼠及人類腸道的病原體,包括微孢子目,溶組織內阿米巴屬,弓形蟲,賈第鞭毛蟲,及隱孢子蟲,這些單細胞寄生生物的定植所引起的宿主免疫反應在人體和實驗動物上已有深入的研究。相比之下,不斷有證據表明,原生生物群落定居于哺乳動物腸道內,成為脊椎動物微生物組學的一部分。其中較為普遍和經典的原生生物有不等鞭毛類、變形蟲、副基類等,它們在體內是共生或是致病仍舊神秘而充滿爭議。這類物種在對機體的免疫系統的作用一直被忽略。因此作者描述了此前未被發現的一類與嚙齒類動物共生的原生動物---小鼠三毛滴蟲(T.musculis),它能使上皮細胞的炎癥體激活,刺激IL-18釋放,從而抵抗細菌對宿主粘膜的感染。但在動物模型中發現此種反應會對結腸炎及結直腸腫瘤轉歸產生不利影響。


RESULTS:

小鼠腸道原生動物共生的鑒定

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

Figure1.A,B:來自西奈山動物中心的研究人員在例行分析C57BL/6小鼠腸道組織時,發現本中心飼養的小鼠比外部購買的小鼠的腸道中有更多的CD45+細胞。將Jackson實驗室購買的小鼠及西奈山動物中心飼養的小鼠的結腸粘膜固有層細胞進行流式細胞術分析,發現西奈山動物中心的小鼠粘膜固有層中CD45+細胞顯著高于外部購買的小鼠(Figure1A)。CD45.2+細胞計數也得出同樣結果,p<0.001(Figure1B)。

Figure1.C:左圖為Jackson實驗室及西奈山實驗動物中心小鼠血清中IgA濃度,右圖為Jackson實驗室及西奈山實驗動物中心小鼠結腸組織標本中的IgA濃度,作者發現西奈山實驗動物中心的小鼠血清及結腸組織標本的IgA均顯著升高,而Jackson實驗室的小鼠則不存在這種現象,p<0.001。

Figure1.D:對腸腔進行灌洗,用流式細胞技術分析,發現西奈山實驗動物中心的小鼠腸腔內IgA陽性細胞(50%)明顯多于Jackson實驗室購買的小鼠(7%)。

Figure1.E,F:將D圖中的IgA陽性細胞進行細胞離心涂片,吉薩姆染色,并用顯微鏡觀察(40X),發現了一種類似于副基類原生生物的單細胞,有鞭毛的微生物。掃描電鏡顯示,這種微生物緊緊貼附于腸道上皮細胞表面。

Figure1.H:研究人員對這個新發現的微生物很感興趣,于是將其DNA提取出來,進行了ITS PCR-DNA測序,發現這是一種新的原生動物寄生蟲,于是將他命名為小鼠三毛滴蟲(T.mu)。進化分析顯示T.mu是獨立的存在的,且與毛滴蟲科的分支有95%的親緣關系。

Figure1.G:作者十分好奇,T.mu的存在是否與腸道組織這中的固有免疫細胞增多及IgA水平升高有關,于是作者將分離純化的T.mu灌入外部購買的B6小鼠胃內。灌胃后不同時間對T.mu的定植進行分析,發現其定植是終身的且在被定植的小鼠后代中也存在。更重要的是,作者發現灌胃形成的T.mu定植小鼠每克盲腸組織中含有的原生生物數量與自然定植小鼠之間無明顯差異。

Figure1.I:作者發現盡管腸道組織造血干細胞明顯擴增,但是卻并沒有找到T.mu定植小鼠粘膜損傷的組織學證據。圖示與對照組相比,T.mu感染小鼠結腸及盲腸組織僅有輕度上皮細胞及杯狀細胞增生。

Figure1.J:將對照組及T.mu感染組小鼠結腸及盲腸組織的染色片進行的病理學評分,如小圖1、3所示兩組之間無明顯差異;對結腸及盲腸組織切片進行每高倍鏡視野下杯狀細胞計數,如小圖2、4所示T.mu感染組小鼠杯狀細胞數量顯著高于對照組小鼠。

上述結果表明,排除事先存在的微生物群落的影響后,T.mu是成年小鼠腸道微生物群落的一部分,其定植對宿主無急性損傷。


T.mu定植后迅速在結腸組織內形成不同的免疫景觀

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

我們先來看一個新技術,利于下文的理解。

CyTOF:質譜流式細胞技術是利用質譜原理對單細胞進行多參數檢測的流式技術。它繼承了傳統流式細胞儀的高速分析的特點,又具有質譜檢測的高分辨能力,是流式細胞技術一個新的發展方向。質譜流式細胞技術可以實現對細胞群體進行精準的免疫分型,對細胞內信號傳導網絡進行全面的分析,分析細胞亞群之間的功能聯系,以及對于大量樣品的高通量多參數檢測。

為了探究T.mu是否與腸道組織固有免疫細胞的增殖相關,作者利用流式細胞技術及質譜流式細胞技術對T.mu定植后不同時間的結腸固有層細胞進行分析。

Figure2.A:用2×10^6高純度的T.mu灌入B6小鼠胃中,對照組用等量PBS灌胃處理,8周后,取結腸粘膜固有層細胞,用抗CD45.2抗體染色后進行流式細胞分析。如圖所示,T.mu處理組小鼠CD45陽性細胞比例明顯高于對照組。

Figure2.B:顯示了對照組小鼠及T.mu定植組小鼠結腸粘膜固有層細胞中CD45陽性細胞的絕對值。如圖所示T.mu處理組小鼠CD45陽性細胞數明顯高于對照組,p<0.001。

Figure2.C:作者用質譜流式細胞分析了高純度T.mu處理后一周,小鼠結腸組織內髓系免疫細胞組成。通過對照組及T.mu處理組對比可見T.mu定植后結腸組織內免疫細胞構成的改變。如圖所示,單核細胞增多,巨噬細胞增多,CD103–CD11b+樹突狀細胞增多,中性粒細胞增多。

Figure2.D,E:通過流式細胞分析及細胞計數,作者發現髓系免疫細胞組成的改變與巨噬細胞產生TNF-a增多及Ly6Chi 單核細胞浸潤增強有關。

Figure2.F,I:我們知道IL-17和 IFNɤ由CD4+Th細胞(Th1)產生,而 IL-5 和IL-13由Th2細胞產生。作者同時發現,T.mu定植2周后,IL-17和 IFNɤ標記陽性的細胞較對照組明顯升高,而IL-5 和IL-13標記陽性的細胞卻與對照組無明顯差異。

Figure2.J:CD4+IFNɤ+Th1細胞在定植后2月出現峰值并趨向水平,而CD4+IL-17+Th17細胞在定植后2-3周升高,且峰值較前者低。

以上數據顯示,T.mu定植動物中,T.mu是驅動免疫調節的主要因素。因此作者就思考究竟是什么在推動著小鼠體內的T.mu誘發Th1細胞和Th1細胞的免疫反應?


結腸組織中不同樹突狀細胞各有分工幫助定植后的T.mu形成粘膜免疫

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

Figure3.A:CCR7是一種細胞因子受體,能控制樹突狀細胞DC從粘膜遷移至腸系膜引流淋巴結,Ccr7-/-小鼠的腸系膜引流淋巴結中缺乏遷移的DCs。如圖所示,對照組及Ccr7-/-組小鼠分別經純化T.mu灌胃,14天后,對小鼠結腸粘膜固有層細胞進行分析,T.mu定植并沒有使得Ccr7-/-組小鼠出現Th1及Th17細胞增殖,這說明在活體中,T.mu定植引起效應性T細胞的反應,必須存在DCs遷移才能發生。

粘膜固有層的DCs包含許多不同的亞型,其中CD103+CD11b+F4/80–Flt3+ DCs需要轉錄因子干擾素調節因子4(IRF4)參與其分化,這類DCs主要驅動粘膜組織的Th2及Th17分化。CD103+CD11b-F4/80–Flt3+ DCs需要轉錄因子干擾素調節因子8(IRF8)參與其分化,這類DCs主要驅動粘膜組織的CD8+T細胞免疫。為了更直接地證明T.mu定植小鼠中,各類型的DCs是如何誘導效應T細胞增殖,作者使用了DC特異性敲除的細胞株,這些細胞株缺乏特定的DC亞型。

Figure3.B,C,D:Batf3-/-小鼠粘膜固有層細胞缺乏CD103+CD11b– DCs但擁有CD103+CD11b+ DCs,因此它無法引起T.mu定植小鼠結腸粘膜固有層的CD4+IFNγ+ Th1細胞增殖,但能使CD4+IL-17+ Th17細胞增殖。

Figure3.E,F:由于IRF8基因在CD103+DC分化中起到重要作用,IRF8基因缺失小鼠同樣不能誘發T.mu特異性Th1細胞反應。作者將Cd11cCre小鼠與Irf8flox/flox小鼠,得到Irf8△DC小鼠,這種小鼠缺乏CD103+CD11b– DCs且無法誘導CD4+IFNγ+ Th1細胞增殖,但其誘導的CD4+IL-17+ Th17細胞增殖與Irf8flox/flox小鼠誘導的CD4+IL-17+ Th17細胞增殖無明顯差異。

Figure3.G,H:為了證明CD103+CD11b+F4/80–Flt3+ DCs在T.mu定植后誘導產生免疫反應的的作用,作者將Cd11cCre小鼠與Irf4flox/flox小鼠,得到缺乏CD103+CD11b+ DCs的Irf4△DC小鼠。在T.mu定植2周后,Irf4flox/flox小鼠與Irf4△DC小鼠結腸粘膜固有層的CD4+IFNγ+ Th1細胞增殖之間無明顯差異,而Irf4△DC小鼠結腸粘膜固有層的CD4+IL-17+ Th17細胞增殖明顯少于Irf4flox/flox小鼠。

以上結果表明,T.mu定植個體中,CD103+CD11b– DCs與CD103+CD11b+ DCs在誘導Th1,Th17免疫的過程中起著不同的作用。


T.mu通過激活ASC及IL-18從而形成結腸的適應性免疫

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

Figure4.A:IL-12和IL-18與Th1細胞免疫的誘導相關。作者發現T.mu定植的結腸粘膜中IL-18釋放水平較對照組升高,p<0.001。

Figure4.B:于是作者就試圖去證明IL-18產生增多是否參與誘導T.mu定植小鼠的Th1細胞免疫反應。作者發現T.mu定植在IL-18-/-小鼠體內后,CD4+IFNγ+ Th1及CD4+IL-17+ Th17的增殖被阻斷。

Figure4.C:前體IL-18在caspase-1的激活下形成成熟且有活性的IL-18。Caspase-1的激活由一種稱為“炎癥小體”的胞漿多蛋白復合物所驅動,在多數情況下還需要連接蛋白---凋亡相關點狀蛋白(ASC)參與。IL-18可由許多不同的細胞產生,包括腸道上皮細胞,基質細胞及造血細胞。作者想知道在T.mu感染后,究竟是上皮細胞還是造血細胞誘導IL-18產生。這里介紹一下骨髓嵌合體小鼠:僅指骨髓系統細胞為異性狀的嵌合體小鼠,為與免疫、造血系統有關的實驗所使用。從 A系統的小鼠中采取骨髓細胞,在除去混存 T淋巴細胞后,用致死量的放射線(約 100 R)照射的 B系統或( A× B) F1 移于小鼠(通過靜脈注射),此時移入骨髓細胞中的造血干細胞在受體內增殖分化,生成所有種類的血細胞(包括淋巴細胞)。結果是受體內的血球所有 A系統的全被代換。由于這些細胞的作用,受體可免除放射線致死。作者將野生型小鼠用致死量的射線照射,并分別移植IL-18+/+ 及IL-18-/-骨髓細胞,形成兩種類型小鼠即IL-18+/+BM 及IL-18-/-BM。IL-18-/-BM小鼠粘膜造血區室內缺乏IL-18。8周以后,實驗組用T.mu處理,對照組做相應對照處理,作者發現與對照組相比,IL-18+/+BM 及IL-18-/-BM小鼠在T.mu定植后的免疫反應無明顯差異,這表明T.mu驅動的結腸Th1,Th17免疫反應是由結腸上皮細胞產生的IL-18所控制的。

Figure4.D:為了進一步探索IL-18在T.mu感染的宿主免疫反應中的作用,作者用T.mu感染了Asc-/-小鼠,這種小鼠無法產生有活性的caspase-1和具有生物活性的IL-18。同樣,作者發現Asc-/-小鼠在T.mu感染后并不能在結腸組織引起Th1,Th17反應性升高。這進一步證明了炎癥小體在T.mu相關的適應性免疫反應中的重要作用。

Figure4.E:ASC驅動caspase-1的活化能同時使IL-1β前體分離。然而,作者用T.mu感染IL-1r-/-小鼠后發現,IL-1r基因缺失對小鼠結腸粘膜誘導CD4+IFNγ+ Th1及CD4+IL-17+ Th17免疫反應較小。


T.mu定植后通過激活炎癥小體從而保護粘膜免受細菌感染

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

前面的研究表明:T.mu定植后,小鼠大腸及盲腸產生的強烈的Th1細胞增殖反應,于是作者就想知道T.mu在宿主粘膜防御機制中的潛在作用。因此,作者進一步深入研究,T.mu定植對沙門菌引起的小腸結腸炎的結局是否有影響。

Figure5.A:T.mu定植14天后,分別使對照組和T.mu定植組感染沙門菌。作者驚奇地發現,對照組在沙門菌感染后,盲腸炎癥十分嚴重,而T.mu定植組在沙門菌感染后盲腸切片HE染色幾乎沒有發現炎癥改變。在感染沙門菌之前,所有病理性參數包括結腸多核粒細胞浸潤、粘膜水腫、杯狀細胞減少、以及上皮細胞整合在T.mu定植組中均明顯于對照組。

Figure5.B:如圖所示,對照組和T.mu定植組小鼠的糞粒、盲腸中沙門菌菌落形成單位(CFU)均無明顯差異,表明兩組的沙門菌感染程度相近。同時作者發現T.mu定植組小鼠的腸系膜引流淋巴結、脾臟中的沙門菌菌落形成單位(CFU)較對照組明顯減少。

Figure5.C,D:上述結果表明結腸上皮細胞釋放的IL-18在T.mu誘導的免疫中有重要作用。于是作者便提出一個問題, IL-18是否參與T.mu介導的沙門菌感染的粘膜保護作用。于是作者再次設計了實驗。將沙門菌感染的T.mu定植小鼠分為兩組,分別連續三天注射200ugd IgG或中和性抗IL-18抗體。作者發現與IgG組相比,注射中和性抗IL-18抗體顯著削弱了T.mu介導的沙門菌感染的粘膜保護作用,并加重了沙門菌感染。

以上數據表明,在含有T.mu的微生物群中,T.mu通過誘導炎癥小體驅動的結腸上皮細胞IL-18釋放,從而顯著增強粘膜抗感染能力。


T.mu定植增加了致病性炎癥的易感性

原生生物使宿主免受腸道細菌感染

結腸組織中持續存在的高水平的炎癥分子引發作者的思考,T.mu是否會有助于定植小鼠的致病性炎癥。因此作者將普通小鼠及GF小鼠的免疫缺陷重組激活基因2(Rag-/-)敲除小鼠用T.mu處理,2周后注射高純度的CD4+CD45RBhi效應T細胞。將效應T細胞注射入Rag-/-小鼠體內會使其出現腸道炎癥并引起持續性體重下降,而GF小鼠則不會出現此類癥狀。

Figure6.A: 結果表明,事先感染T.mu的普通小鼠及GF小鼠在T細胞轉入后比未感染小鼠病情更加嚴重,從開始到T細胞轉入后2 溫馨提示:87%用戶都在生物谷APP上閱讀,掃描立刻下載! 天天精彩!
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